[其他]白细胞三烯A4水解酶放射免疫测定药盒及制备工艺

说明书

本发明属生物化学领域。

白细胞三烯A₄在白细胞三烯A₄水解酶（LTA₄H）作用下，产生白细胞三烯B₄。白细胞三烯B₄是一种重要的生物活性物质，是炎症反应和过敏反应中白细胞运动的最有效的激活剂。因而，微量测定白细胞三烯B₄体内合成的维一通路-LTA₄H，这对于研究人体免疫功能有重要意义。

以往测定LTA₄H，使用LTA₄H活性检测法。由于活性检测灵敏性较低，效果不够理想，放射免疫测定方法的优点是灵敏性高，特异性强，是测定LTA₄H的理想方法。

目前，国内外尚无LTA₄H放射免疫测定药盒及其制备方法，本发明的目的是建立LTA4H的放射免疫测定药盒的制备方法，提供特异性强，灵敏，可靠的药盒。

本发明的技术构思是首先由人全血中提取白细胞，再由白细胞提纯LTA₄H;制备抗LTA₄H抗血清;用¹²⁵I标记LTA₄H;进行¹²⁵I-LTA₄H的纯化，最后建立放射免疫测定方法，制成可供科研使用的药盒。

实施方案：

一、由人全血中提取白细胞：

首先将已加入抗凝剂的全血离心，取白细胞粗提液，置于量筒内，加一倍体积的白细胞悬浮液，混合后，自然沉淀10-20分钟，将上清液吸出，离心。取沉渣，为多核白细胞。为保证白细胞的纯度，在离心管中加红细胞溶解液20mL左右，再离心取沉渣为白细胞。放4℃冰箱备用。

二、由白细胞中提取LTA₄H：

（1）将白细胞制成匀浆，离心，去残渣。

（2）加硫酸链霉素轻搅拌，离心，除去核酸类物质，留取上清。

（3）用硫酸铵分段盐析法，留取盐饱和度40-80%的蛋白质沉淀

（4）透析除去样品中的硫酸铵。

（5）二乙基氨乙基（DEAE）纤维素离子交换层析，用活化后的DEAE纤维素制成层析柱，用高盐缓冲液做梯度洗脱。

图1是DEAE-纤维素离子交换层析蛋白质分离图，〔1〕为留取样品部分。被收集样品用超滤器浓缩。

（6）ACA-44凝胶过滤层析。图2是ACA-44凝胶过滤层析的蛋白质分离图。〔1〕为留取样品部分收集于管内，用超滤器浓缩。

（7）高压液相离子交换层析，MOnO    Q层析柱用高盐缓冲液进行梯度洗脱。图3为高压液相MOnO    Q离子交换层析的蛋白质分离图。〔1〕为留取样品部分，收集于管内、用葡聚糖凝胶过滤柱层析脱盐

（8）高压液相羟基磷灰石柱层析。用高盐缓冲液做梯度洗脱，图4为高压液相羟基磷灰石柱层析的蛋白质分离图。〔1〕为留取样品部分。

至此LTA₄H提纯完成。

三、LTA₄H抗血清的制备：

（1）纯化的LTA₄H使用十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳再纯化。取LTA₄H加4倍样品缓冲液，分10份、加入样品胶的样品井内，电泳3-4小时，取下凝胶染色。然后进行脱色，显示LTA₄H在凝胶上的位置，准确裁割下来。将凝胶与完全福氏佐剂混合，制成匀浆，备用。

（2）用LTA₄H免疫家兔。给家兔肌注LTA₄H匀浆。2周后，用同样方法加强免疫一次。4周后加强免疫一次，4周后再加强免疫一次。一周后取兔全部血液，凝固后，离心，获得血清。

四、LTA₄H的¹²⁵I标记：

取1-2毫居Na〔¹²⁵I〕，加入5-15微克LTA₄H，然后加入氯铵-T，开始碘化反应。充分混合，3-5分钟后加入Na₂S₂O₅

终止碘化反应。加入碘化钾和0.1%牛血清白蛋白保护碘化蛋白质。使用葡聚糖凝胶柱，分离末与LTA₄H结合的游离¹²⁵I。

五、¹²⁵I-LTA₄H的纯化：