[其他]有生物活性的蛋白质与其生产的方法

说明书

本发明一种在原核生物里表达异源PNA顺序（例如真核生物基因）的方法。在其中一个重要的实施例中，本发明指出了在原核生物里生产具有一个N端为丙氨酸多肽以及用本方法能够生产各种N端为丙氨酰的多肽。也包括能增加牛奶产量大到出人意料程度的一类缬氨酸bGH（牛生长激素）品种。

由真核生物和原核生物表达基因，在基因转录至信使RNA（mRNA）以及随之又把这种mRNA转译成蛋白质中都具有相同的基本步骤时，则要应用细胞内的不同组合以控制这些步骤。

此外，在真核生物里，许多成熟的蛋白质首先被转译成为前一蛋白质;即含有与引导顺序或信号顺序融合的成熟蛋白质顺序的多肽。真核生物的信使RNA（mRNA）编码整套前一蛋白质，它们在转译后被加工除去引导顺序以后才成为这种成熟蛋白质的。真核生物细胞装备有把这样前一蛋白质转变为成熟蛋白质的特异加工机制，原核生物的细胞一般不能识别存在于真核生物的蛋白质里的这种加工处理信号。因此，如果真核生物信使RNA（mRNA）的完整互补DNA（cDNA）转录物被用作DNA顺序在原核生物里来表达，那就只发现前一蛋白质而无成熟蛋白质。前一蛋白质在体外转变为成熟蛋白质是有可能的，但不能没有重要的代价。

在编码成熟蛋白质的DNA顺序在原核生物里用作成熟蛋白质表达的过程中，这一顺序将是没有真核的转译作用和通常包含在作引导顺序DNA里的转译后加工信号。因此，基于效能以及由于原核生物的宿主细胞也许不能识别真核生物的信号，现已证实，要在原核生物系统里表达所克隆的真核基团或其它异源DNA顺序。最理想的是应用原核生物控制讯号。

“异源DNA”一词在此定义为核DNA至少其有一部分序列不是正常地包含在宿主细胞的染色体组内。异源DNA的实例包括，病毒及真核基因，基因此段，等位基因以及合成的DNA顺序但不局限这些。“异源蛋白质”或“异源多肽”一词在此定义为一种蛋白质或多肽，其中至少有一部分氨基酸顺序不是正常地将其密码编在宿主细胞的染色体组里。

原核生物的控制讯号包括一启动子，它引发转录启始和转译控制讯号包括核糖体结合位点，转译启动以及转译停止。除了转译停止信号外，所有这些讯号都必须位于真核基因或其它待表达DNA的前面。

技术界已采用一些方法在原核生物里去表达异源DNA（即真核基因）。其中一个方法是，把编码终产物蛋白的DNA片段与受细菌启动子操纵编码细菌的全部或一部分蛋白的DNA相连接。这种内生的原核DNA也需要有核糖体结合位点及转译启动讯号。这样连接的DNA的表达结果产生一种所谓融合蛋白，它由真核多肽与整个细菌蛋白或部分细菌蛋白组成，这种真核生物的蛋白质的分离就可以用位点特异酶的或化学的方法在内源的一一真核生物的蛋白质融合点上裂解而完成，或用原核生物对多肽顺序的选择降解而实现。

在细菌中，与生产真核生物蛋白融合的蛋白质，有关的出版物包括全欧专利申请47.600（1982，3，17出版）它涉及融合蛋白与非融合蛋白包括，牛前一一生长激素或牛生长激素，在其羧基端（C-）上带有或在氨基端（-N）没有。原核生物蛋白质部分的。英联邦专利申请GB2，073，245A（1981，10，14出版）论及bGH与大肠杆菌E，coliβ-乳酰胺酶（β-Lactamase）的融合蛋白质;E.Keshet等人，核酸研究，（Nucleic    Acid    Research）9∶19-30（1981）论及牛生长激素（bGH）与大肠杆菌β-乳酰胺酶的融合蛋白质;全欧专利申请95，361（1983，11，30出版）论及融合蛋白质包括：依次为，在N基端的内源蛋白质，转译起动信号氨基酸，肠激酶切割优点以及羧基端（C-）上的外源蛋白质（即生长激素）。然而，这些融合蛋白质的方法都是繁琐的，其间在纯化之后还需要进行体外加工处理，而且达到商品化所需酶的成本过高。

不过，由于融合的产物似乎能保护终产物异源蛋白质免受细胞内的降解，因此已成为在原核生物细胞中表达某些真核基因或其它异源DNA的一种有吸引力的系统。细菌细胞似乎能识别出在其处产生的某些真核蛋白质是外来的，因而，在这些蛋白质合成时或刚合成后就尽快地使之降解。为保护目的而设计的融合蛋白质应用内源多肽顺序放在异源蛋白质的氨基端或羧基端。后者方法的例子见于欧州专利申请111，814（1984，6，27出版）其中论及融合蛋白质、包括一种具有一合成的前一端（氨基端）以及在羧基端（C-）上有一大肠杆菌（E，coli）β-半乳糖苷酶（β-galactosida-se）形式的牛生长激素bHG。它的优越性仍然由于象前面讨论过那样需要最后从内生多肽切割异源蛋白而受贬。