[其他]菌苗的制备方法

说明书

本发明与克隆运载体和基因克隆方法有关，特别是与987P纤毛基因克隆的方法有关，也同由此产生含纤毛的菌苗有关。

新生的幼猪腹泻是起因于某些大肠杆菌菌株在小肠中的生长。这些菌株能合成肠毒素（enderotoxims），肠毒素引起腹泻和脱水，而腹泻和脱水又常常造成幼猪的死亡。这些产肠毒素的大肠杆菌菌株的特点是它能够通过纤毛附着到小肠的上皮上，所以能在小肠里迅速增殖。

已经知道大肠杆菌许多不同的纤毛血清型同新生的幼猪腹泻有关，其中主要血清型是K88ac、K88ab、K99和987P等。K88ac、K88ab和K99的基因已经知道是质粒编码的，并已被克隆。然而，987P纤毛的编码基因仍未被克隆，并且还未确定这些基因是在质粒上，还是位于染色体上。

已经认为能够用一种或几种纤毛抗原给母猪接种，从而产生抗体，而这些抗体又转过来会阻止产肠毒素的大肠杆菌附着到幼猪的小肠上进行繁殖，而不引起与感染有关的症状。因而希望生产足够量的纤毛抗原，可以给动物作大规模的疫苗接种。从野生型大肠杆菌分离纤毛，因为纤毛数量很少而有困难。然而，如果纤毛编码的基因能被克隆到适当寄主的高拷贝质粒运载体中，纤毛的表达就可以提高10-100倍，然后这些纤毛能够大量被分离，这样产生的纤毛没有野生型的肠毒素，而野生型的肠毒素可以引起不希望有的疫苗付反应。

常认为987P基因的克隆如果可能的话，也是极为困难的。首先，基因的位置还没有被确定，而且还认为要使987P能够表达需要有非常大的DNA片段。DNA大片段在高拷贝质粒运载体中是特别不稳定的。

本发明为克隆DNA大片段提供组建克隆运载体的方法，包括把DNA大片段和一个分割位点（Partition    locus），插入到一个高拷贝质粒中，如pBR或pACYC基础运载体。

特别优先考虑的质粒是pBR322、pBR329和pACYC184。

本发明也为组建987P纤毛表达的克隆运载体提供方法。

987P纤毛的工作已经使本发明者得到结论，分割位点插入到一个质粒克隆运载体内，如pBR质粒，可使或者增强。DNA大片段稳定地克隆到这种运载体内。

此发明的目的是提供pBTA599质粒，即以前称之为pBR329/par。

进一步的目的是提供重组合质粒pBTA201和pBTA200。

另一目的是要提供包括一个质粒的克隆运载体，这个质粒有一段含有分割位点的DNA片段和一段包含有987P纤毛蛋白编码基因的DNA片段。

本发明也为组建能够表达987P纤毛的克隆运载体提供方法，这方法包括：

（ⅰ）把一段含有分割位点的DNA片段插入到一个合适的质粒，如pBR329，pBR322或pACYC184中。

（ⅱ）把一段含有表达987P纤毛基因的DNA片段插入到（ⅰ）的质粒中。

最优先采用的分割位点是从F小型质粒pML31分离到的SOP位点（如Austin    and    Wierzbick，PLASmlDS，1983.10.73-81，所述）。

本发明进一步提供一株转化了的微生物，即用本发明的方法产生的克隆运载体所转化了的微生物。用于本发明的非常合适的微生物是大肠杆菌。本发明一个优先考虑的特点是用能表达987P纤毛蛋白的克隆运载体转化大肠杆菌，特别优先的是用pBTA201转化。

本发明也提供一种菌苗，它含有能表达987P纤毛蛋白的克隆运载体的并经改造过的大肠杆菌。

另一方面，本发明的菌苗可以包含有从改造过的细菌培养物中分离到的987P纤毛。

图1是本发明的运载体pBTA599的DNA限制性内切酶酶切图谱。

图2是pBTA201的限制性内切酶酶切图谱，52Kb的插入片段和运载体。

克隆运载体的构建：

克隆运载体通过把F小型质粒pML31的分割位点插入到pBR329中构建而成的。

pBR322系质粒缺乏对等分割所需要的功能，这意思是pBR322不能稳定地存在超过50代。然而，分割位点编码一种机制，它保证细胞分裂时质粒也精确地分割（Meacock    and    Cohen，Cell.20，S29-S42，1980。和Tucker    et    al.Cel.38，191-201，1984）。