[其他]以葡萄糖母液间发酵生产异维生素丙钠的方法

说明书

本发明是关于葡萄糖母液为原料，使用萤光假单胞菌AS-5（Pseudmonas    fluoresence    AS-5），通过深层发酵，把母液中的葡萄糖转化为异维素丙钠前体-2-酮基葡萄糖酸钙（calcium    2-ketogluconate），再经甲酯化，烯醇化与内酯化，合成异维生素丙钠（sodium    isovitain    c）的方法。

异维生素丙钠的这种发酵与合成相结合的制备方法，称之为间接发酵法。此法国外已经研究多年，1958年V.Fpfeifer等人利用葡萄糖为原料，通过深层发酵得到2-酮基葡萄糖酸钙。1965年T·T.Misen-heimer等人进一步提高了发酵收率，直到现在仍延用此法。但均以葡萄糖为原料用60-90%硝酸、甲酸、氢氧化钠进行甲酯化和转化生产异维生素丙钠。

本发明采用葡萄厂的大量廉价葡萄糖母液为碳源，该母液是指采用酶法或酸法水解山芋淀粉或玉米淀粉等在制造葡萄糖的生产过程中，离心分离出葡萄糖结晶后的母液，还原糖含量一般在35%-50%。

葡萄糖母液使用时不需预先处理，直接灭菌后加入发酵罐和其他无机盐等成份配成发酵培养基，调节还原糖含量在15%-20%之间，接种后在28℃发酵44小时，发酵转化率在95%以上，发酵结束后将发酵液升温至80℃，经15分钟将菌体杀死，加入活性碳和高岭土，进行过滤，滤液减压浓缩后得到2-酮基葡萄糖酸钙结晶。

2-酮基葡萄糖酸钙再与工业甲醇、工业硝酸一起，在45-50℃下进行甲酯化反应，得到2-酮基葡萄酸甲酯，再将甲酯置入工业甲醇中与工业氢氧化钠甲醇溶液在65-70℃进行烯醇化和内酯化反应，得到异维生素丙钠。再经脱色、重结晶后即可得到异维生素丙钠成品，质量达到1981年版美国食品化学法规（Food    chemial    codox    USA    1981）所规定的标准。

由于本发明采用廉价的原料，且生产方法简单，收率较高，使异维生素丙钠的生产成本大幅度降低，经济效益显著。

同时，为葡萄糖厂大量葡萄糖母液合理利用开创了一条新的途径。

现举例说明如下：

例一

先将萤光假单胞菌AS-5接种在牛肉汁琼脂斜面培养基上，在28℃培养24小时，后再接种到种子摇瓶培养液中（培养液成份：蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母膏0.2%、牛肉膏0.1%、硫酸镁0.07%、玉米油0.2%，用自来水配制，调至PH7.0，分装于带挡板的三角瓶中）。28℃培养16小时，移种到用葡萄糖母液配制的发酵培养基中，该发酵培养基中含有葡萄糖母液1300毫升（用酶法水解山芋淀粉制取葡萄糖结晶后的一母，还原糖含量51%，折纯糖为743克）、蛋白胨10克、玉米浆12克、MgSO₄·7H₂O1.2克、CaCO₃200克，用自来水溶解，定容到4000毫升，调至PH8.0。常法灭菌后，在无菌条件下注入6升玻璃发酵罐，并将培养好的液体菌种也在无菌下接入发酵罐，在28℃，通气培养44小时，即可放罐。发酵液中2-酮基葡萄糖酸钙的含量达179mg/ml。对糖的发酵收率为96.4%。

将发酵溶液升温至70℃，10-15分钟后，加活性碳和高岭土过滤，滤液在55℃-60℃减压浓缩，待大量2-酮基葡萄糖酸钙结晶析出时，冷却到0℃左右，滤出结晶，干燥后得到2-酮基葡萄糖酸钙594.7克。

称取594.7克2-酮基葡萄糖酸钙，加工业甲醇（含量95%以上）1189ml，工业浓硝酸（含量96%）125ml，40-45℃反应5小时，降温到5℃，1小时后，滤出2-酮基葡萄糖酸甲酯，用冷却甲醇洗净，得到462克熔点为172℃的2-酮基葡萄糖酸甲酯，收率为77.7%。

2-酮基葡萄糖酸甲酯462克加4600ml甲醇，加热水65℃，加入氢氧化钠甲醇溶液（工业氢氧化钠83.2克，水64.6毫升，工业甲醇2170毫升溶解后加入）反应20分钟后加入866毫升水，冷却到0℃，于是大量异维生素丙钠结晶析出，放置2-3小时后，滤出结晶，并用少量冷甲醇洗涤，得到的结晶经真空干燥，得到429.7克异维生素丙钠。收率为93%。

例二

条件方法同例一，只是葡萄糖母液改用酶法水解山芋淀粉制取葡萄糖的最后母液（二母），还原糖含量35.5%，6升玻璃发酵罐，投二母1600ml，折纯糖为624.8克，经发酵、提取得2-酮基葡萄糖酸钙486.7克，甲酯化与转化得异维生素丙钠346.6克。发酵收率98%，提取收率82%，甲酯化收率77%，转化收率92.5%。

例三