[发明专利]用生物转化生产10-羟基喜树碱的方法

说明书

本发明属于应用微生物方法转化的技术领域。

于1966年开始，Wall等报导从我国引种的喜树（Camptotheca    acuminata    Denc）中分离得到抗癌有效成分喜树碱

Camptothecine（Ⅰ），10-羟基喜树碱10-Hydroxy

Camptothecine（Ⅱ）和10-甲氧基喜树碱10-Methoxy

Camptothecine（Ⅲ）等。1971年Stork和Schultz等完成了喜树碱的全合成工作，我国以1969年起，陆续从喜树中也分离到喜树碱和10-羟基喜树碱等有关的化合物，1976年又完成了喜树碱和10-羟基喜树碱的全合成。

10-羟基喜树碱的化学结构与喜树碱相似，仅在10位上的氢由羟基取代，经动物药理和临床试验证明，在治疗肿瘤方面比喜树碱有较好治疗效果和较低的毒副反应。于1977年10-羟基喜树碱作为肿瘤临床的一只新药，在国内通过鉴定，并应用于治疗肝癌、胃癌、头颈部肿瘤和白血病等。

过去10-羟基喜树碱从喜树中提取，得率甚低，约为生药的十万分之二，提取过程中需用大量有毒的氯仿和甲醇，以及接触有毒的喜树碱等本身物质，致使10-羟基喜树碱的生产发生困难，成本昂贵。制造10-羟基喜树碱的全合成虽然获得成功，由于步骤多;总收率较低，也无生产实际意义。

本发明的目的是为了解决10-羟基喜树碱的生产问题。本发明采用生物转化的方法，将喜树中含量较高的喜树碱（提取得量为万分之七左右），转变为10-羟基喜树碱。作者曾于1978年在科学通报上简单地报导了利用曲霉T-36菌株，可将喜树碱转化为10-羟基喜树碱，后又经过菌种的诱变，菌体生长和转化条件的改进。现采用黄曲霉T-419菌株，使转化率从20%提高到50%以上。特别又研究成功采用了隋性大孔树脂分离提取10-羟基喜树碱的新工艺，进一步降低了生产成本和解决了劳动保护问题，使10-羟基喜树碱具备了实际生产的条件。

利用本发明生产10-羟基喜树碱比原来从喜树中提取10-羟基喜树碱的方法有如下优点。

1.扩大了生产10-羟基喜树碱的来源，用原来从喜树中提取的方法，只能得到十万分之二的10-羟基喜树碱，而另一产量较高的喜树碱因临床毒性较大，而成为无用物质。通过本发明可将这部分喜树碱转变为临床上有较好评价的10-羟基喜树碱。

2.革除了大量氯仿和甲醇以及上硅胶柱分离的工艺，使操作人员免去接触大量有毒气体和喜树碱类本身的粉末。

3.节约了大量溶剂和试剂，再利用了喜树碱后致使10-羟基喜树碱的生产量可大大增加等，使生产成本要比原方法低得多。

一、生物转化的菌株鉴定

我们共筛选了数百株真菌，其中T-36菌株通过对其转化产物的理化分析证明，确具有转化喜树碱为10-羟基喜树碱的能力，后又将T-36菌株的孢子经过紫外光处理10分钟后，所分离得到的变株T-419其形态和培养的基本特征与T-36菌株一致，仅在10-羟基喜树碱的转化率上比T-36菌株高6-10%，故以后的工艺试验皆用黄曲霉菌株T-419，T-419菌株的形态和培养特征：T-419菌株在Czapek′s固体培养基上菌落近圆形，很快向四周蔓延，菌落表面带黄绿色的分生孢子，菌丝无色，无可溶性色素分泌。菌丝有横膈，为多细胞的菌丝体。分生孢子梗的顶端膨大成半球形的顶囊，在顶囊表面以辐射方式长出一层或双层小梗，在小梗顶端形成一串分生孢子。这些都是典型的曲霉属Aspergillus的形态特征，在电子显微镜下观察其孢子表面光滑近球形。由于孢子呈黄绿色，故其种应命名为黄曲霉菌株T-419

二、转化产品的鉴别

喜树碱通过黄曲霉菌株T-419转化后的培养液，菌丝用乙醇提取，滤液用乙酸乙脂提取，分别浓缩后合并，再甲醇迥流，上硅胶柱层析，用氯仿冲洗，除去喜树碱成分，然后收集2-4%甲醇的氯仿的冲洗液，浓缩后得到固体粉末，再在氯仿∶甲醇（1∶1）混合溶剂中结晶数次，即能得到纯的黄色柱状结晶的转化产物。其熔点旋光、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱等的理化性质数据都与天然分离得到的10-羟基喜树碱完全一致（表1），采用隋性大孔树脂分离获得10-羟基喜树碱经质谱、红外、紫外、核磁光谱分析也与天然的10-羟基喜树碱完全一致。

三、200公升罐内的生物转化工艺实例

1.生物转化的工艺流程：

2.孢子培养：