[发明专利]用于敲除T细胞中的TRAC和B2M的试剂和方法

说明书

本发明涉及用于CAR‑T疗法的T细胞中的TRAC和B2M双重敲除。具体而言，本发明涉及具有较高敲除效率的靶向TRAC和B2M的sgRNA序列及其使用方法。更具体地，本发明提供一种sgRNA套组，其包含：核苷酸序列如序列3、6、9、12、14、15、16、18和19任一所示的靶向B2M基因的sgRNA，和核苷酸序列如序列37和41任一所示的靶向TRAC基因的sgRNA。另一方面，本发明提供一种生成TRAC/B2M双阴性T细胞的方法，其包括：使用本发明的sgRNA套组处理T细胞，使得其中的B2M基因和TRAC基因被敲除。

技术领域

本发明涉及T细胞中的 TRAC和 B2M双重敲除。具体而言，本发明涉及具有较高敲除效率的靶向 TRAC和 B2M的sgRNA序列及其使用方法。

背景技术

截至2021年6月，全球范围内已经上市了五款CAR-T产品，这五款产品都属于自体CAR-T疗法，其制备需要采集癌症患者的外周血，分离T细胞，进行基因改造，体外培养后对患者进行回输，属于“量身定制”的个体化治疗方式。自体CAR-T治疗正在彻底改变癌症治疗的方式和方法，但也存在着一些明显的局限性。首先自体CAR-T生产周期较长，患者需要较长的等待时间，有些患者可能错过最佳的治疗窗口。其次，自体CAR-T产品的质量一致性相对较差。患者T细胞状态不一致会影响产品的效能，部分患者面临制备失败的风险，因此并非所有适应症患者都可以接受治疗，总体来说每次制备的细胞数量和质量一致性得不到充分的保证。另外，自体CAR-T制备受到起始原料的限制，很难进行二次制备和治疗。最后，自体CAR-T物流复杂，规模效率相对低下，这种个体化治疗导致成本高昂。

同种异体CAR-T，又称通用型CAR-T（UCAR-T）、即用型CAR-T，是指从健康志愿者体内提取分离T细胞，进行相关改造，制备成CAR-T细胞，使其既能规避移植后的免疫排斥反应，又能发挥既定的抗癌作用。可以一次性制备、储存大量的CAR-T细胞，当有患者需要CAR-T细胞的时候，可以达到“随取随用”的目的。与自体CAR-T相比，异体CAR-T能够从库存按需交付产品，更快的治疗时间能够使更多的患者接受治疗并获得潜在的有益结果，同时根据需要可进行多次给药。其次，异体CAR-T由于采用统一的来自健康志愿者的PBMC，细胞活力和状态更好，质量一致性较好，具有更加可预测的安全性和功效，可以治疗所有适合的患者。最后，异体CAR-T一次生产即可治疗大批的患者，扩大生产规模可以进一步降低成本，降低药物价格。

异体CAR-T具有的以上优势使其成为CAR-T细胞治疗领域未来的主要趋势。根据Nature杂志统计，血液恶性肿瘤药物最受关注的5个适应症依次是复发难治性NHL（DLBCL、FL、MCL和CLL）和MM。如果CAR-T疗法在实体瘤方面取得重要突破，将使更多患者受益。异体CAR-T的成功研发，将使CAR-T细胞免疫治疗成为癌症患者随时能够使用，并且能够用得起的药物，获得巨大的临床和市场应用价值。

异体CAR-T最大的科学障碍在于“移植物抗宿主病(GVHD)”和“宿主抗移植物病(HVGD)”。体内的T细胞通过TCR识别抗原呈递细胞表面HLA分子结合的抗原肽，从而杀伤异源细胞。GVHD是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击。HVGD在移植领域指受者对供者组织器官产生的排斥反应，主要是由于在移植物中识别了非自身的HLA分子。对于异体CAR-T来说，即宿主T细胞杀伤供者的T细胞。