[发明专利]一种简单、快速的体细胞化学重编程方法

说明书

本发明提出了一种简单、快速的体细胞化学重编程方法，用于制备多潜能干细胞，属于干细胞与再生医学领域。包括：1.通过提高小分子CHIR99021的使用浓度，将第一阶段诱导试剂中的3个小分子和1个细胞因子减去；2.本发明显著提高化学重编程的诱导效率（大于10倍），并且将诱导时间减少到16天；3.通过该技术获得的化学诱导的多潜能干细胞系具有多潜能性。通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程，制备化学诱导的多潜能干细胞，可用于体外疾病模型、药物筛选、毒性测试以及细胞命运转变机制等研究领域。

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学领域，具体涉及一种简单、快速的体细胞化学重编程方法。

背景技术

干细胞研究的最终目标是将干细胞来源的功能细胞用于移植治疗重大疾病。多潜能干细胞可以稳定地长期扩增，能够产生无限的种子细胞；同时，多潜能干细胞可以分化产生机体所有类型的功能细胞，在细胞治疗、药物筛选和建立疾病模型等方面具有广阔的应用前景，其应用有望带来一场新的医学革命。如何在体外建立安全的、稳定的多潜能干细胞作为种子细胞是干细胞研究的关键问题。

2006年，日本京都大学Shinya Yamanaka 研究小组用病毒转导方式将 Oct4， Sox2， Klf4和 c-Myc（OSKM）四个基因转入小鼠胚胎成纤维细胞，可以使之转变为类似胚胎干细胞的“诱导的多潜能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）”，建立了iPS技术。该技术一方面打破了传统建立胚胎干细胞系存在的伦理限制，另一方面，也为建立病人自体特异性多潜能干细胞系提供了全新的方法，从而为目前细胞治疗中异体移植所引起的免疫排斥问题提供了解决方案。此外，iPS技术还被广泛应用于疾病模型建立、新药开发等研究领域。因此，iPS技术的建立被誉为再生医学领域的里程碑式的工作，并于2012年获得诺贝尔生理或医学奖。iPS技术是通过细胞内源转录因子的过表达，驱动细胞命运发生直接转变，其诱导过程难以控制。更重要的是，iPS技术需要通过病毒转染方式转入4个基因，病毒可能会将自己的DNA片段整合到细胞的基因组上、破坏基因组的稳定性，会导致iPSCs分化获得的功能细胞具有成瘤的风险。因此，建立一种安全、可控的细胞重编程技术是再生医学领域一个重要的科学问题。

2013年，北京大学邓宏魁团队在Science杂志发表了一项原创性的成果，即不依赖卵母细胞和转录因子等细胞内源物质，仅使用外源性化学小分子就可以逆转细胞命运，将小鼠体细胞重编程为化学诱导的多潜能干细胞（Chemically induced Pluripotent StemCells, CiPSCs），开辟了全新的体细胞化学重编程技术。同胚胎干细胞类似，CiPSCs可分化成为包括血液、肝脏、神经和肌肉等各种功能细胞。相比传统方法，化学小分子具有易于合成、保存和规范化的特点，同时其生物学效应具有可塑性和可逆性，添加操作方便，因此可以通过对小分子浓度、添加时间及不同组合的微调实现对重编程过程的精细化操控。更重要的是，小分子诱导体细胞重编程技术作为非整合方法，规避了传统遗传操作引发的安全问题，有望为临床治疗提供更加安全的种子细胞。化学重编程技术开辟了一条全新的具有应用前景的体细胞重编程途径。这不仅有助于更好地理解细胞命运决定和转变机制，而且为未来再生医学治疗重大疾病带来新的可能。

尽管化学重编程技术克服了iPS技术的缺陷，具有更好的临床应用前景，但在以下三方面仍需要进行改进：1.化学重编程技术包含3个诱导阶段，每个阶段使用多个小分子，使得实验操作复杂；2.化学重编程技术全程诱导时间长于iPS技术，一般需要至少30天才能实现稳定的诱导；3.化学重编程技术实现较高效的诱导是通过在诱导中间阶段将细胞进行传代实现的，然而传代处理增加了诱导时长和诱导体系的复杂性。

发明内容