[发明专利]一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用

权利要求书

1.一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时采用表达载体pRS426，过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因；

其中，所述酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743。

3.如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

在酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C基因的核苷酸序列设计引物，构建带有myc-HA标签的YML115C基因过表达的重组质粒；

(2)对步骤(1)构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母菌株Saccharomycescerevisiae BY4743中进行表达；

(3)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上进行筛选，在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落，即为高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，琼脂2-3％，用ddH₂O定容至1L；

其中，上述百分数均为质量浓度百分数。

6.如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株在磷脂酰丝氨酸生产中的应用。

7.利用如权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：

将高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株通过三区划线涂布于尿嘧啶营养缺陷型固体培养基平板上，25～30℃培养48-72h，将活化后的菌种，接1-2环于装有3-5mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基中，25～30℃，180-220rpm条件下培养12-20h即为种子培养液，将种子培养液按2-15％接种量接入尿嘧啶营养缺陷型液体培养基中，25～30℃，180-220rpm条件下培养12-24h，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物(DO Supplement–Ura)0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，琼脂2-3％，用ddH₂O定容至1L；

每1L尿嘧啶营养缺陷型液体培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，用ddH₂O定容至1L；

其中，上述百分数均为质量浓度百分数。

9.一种如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的细胞内的磷脂酰丝氨酸含量测定的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)酿酒酵母工程菌株发酵结束后，收集全部菌体；

(2)将收集到的菌体进行冷冻干燥、破碎；

(3)使用有机溶剂萃取，合并溶剂层；

(4)使用有机溶剂萃取多次，合并溶剂层；

(5)氮气吹干有机溶剂层，并复溶提取物质；

(6)使用UPLC/MS对所得到的物质进行检测；

(7)计算细胞内磷脂酰丝氨酸含量。

10.一种如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的生长曲线的测定方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)将产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株和对照菌株即转化含有pRS426的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4743分别接种于尿嘧啶营养缺陷型液体培养基的试管中，25～30℃，200～220rpm/min的条件下培养12-18h；

(2)分别取30μL、40μL、50μL菌液依次加入含有1mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基的EP管中，振荡混匀，取200μL加入100孔板中，并且取200μL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基作为对照；将100孔板放置于全自动生长曲线测定仪中，25～30℃培养，每隔1h测定波长600nm处的吸光度值；

(3)以培养时间X为横坐标，OD₆₀₀值Y为纵坐标，绘制生长曲线。