[发明专利]一种提高L-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌

说明书

本发明公开了一种提高L‑缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌。重组菌为在可以生产缬氨酸的大肠杆菌（如大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045 CGMCC No.22721或大肠杆菌W3110）中通过敲除thiE基因、敲除mdh基因或敲除thiE基因的同时敲除mdh基因获得的工程菌。发酵该重组菌可以提高L‑缬氨酸的产量。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高L-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌。

背景技术

L-缬氨酸在食品、医药、保健品﹑饲料等领域均有着重要的应用。在食品领域，L-缬氨酸可以补充营养，促进身体生长，提供能量。在医药领域，L-缬氨酸可用于输液和注射液，促进外科创伤愈合。国内饲料级L-缬氨酸的出口量达到3万吨以上，年均增长率20%。

目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-缬氨酸的生产但大肠杆菌对L-缬氨酸非常敏感，当L-缬氨酸生产菌胞内的L-缬氨酸不能及时排出产生积累时，会严重抑制大肠杆菌的生长，进而导致菌胞内L-缬氨酸的合成受到抑制，导致L-缬氨酸的产量非常低。

发明内容

本发明的主要目的为如何提高L-氨基酸的产量，本发明的目的不限于所描述的主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它目的。

本发明首先保护一种工程菌甲，可为体内抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性的微生物；

所述微生物可以生产缬氨酸。

所述硫胺磷酸合酶为E1）、E2）或E3）：

E1）氨基酸序列如SEQ ID No：6所示的蛋白质；

E2）将E1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

E3）在E1）或E2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

上述工程菌甲中，所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。

所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：3所示的ΔthiE-Up-Down片段实现。

上述工程菌甲的体内还抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。

所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：

F1）氨基酸序列如SEQ ID No：7所示的蛋白质；

F2）将F1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

F3）在F1）或F2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

上述工程菌甲中，所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。

所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB-mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的Δmdh-Up-Down片段实现。

本发明还保护一种工程菌乙，可为体内抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性的微生物；

所述微生物可以生产缬氨酸。

所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：

F1）氨基酸序列如SEQ ID No：7所示的蛋白质；