[发明专利]一种自然杀伤细胞、其制备方法及用途

权利要求书

1.一种自然杀伤细胞，其特征在于，所述自然杀伤细胞的TGFBR2基因经过碱基编辑以在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑；

所述碱基编辑将自然杀伤细胞中TGFBR2基因上的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G。

2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，所述自然杀伤细胞为源于外周血细胞的NK细胞、源于脐带血的NK细胞、胚胎干细胞诱导的NK细胞或诱导多能干细胞诱导的NK细胞中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，将TGFBR2基因中核苷酸序列如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .17任一所示的靶点所对应碱基编辑窗口的碱基C突变至T，和/或将碱基A突变至G。

4.根据权利要求3所述的自然杀伤细胞，其特征在于，TGFBR2基因上如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.17任一所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.65任一所示的核苷酸序列。

5.权利要求1-4任一所述的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将碱基编辑系统导入天然自然杀伤细胞进行编辑，获得所述自然杀伤细胞。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将碱基编辑系统导入天然自然杀伤细胞的方法选自电穿孔法、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述电穿孔法中使用的电转仪系统选自LONZA系统、Thermo的Neon转染系统或Gibco CTS Xenon电转染系统中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述电穿孔法中使用的电转仪系统为LONZA系统、型号为4D-Nucleofector的电转仪时，电转程序选自CM137、CM158或CM189；

或，电穿孔法中使用的电转仪系统为Thermo电转染系统、型号为Neon电转染仪或CTSXenon电转染仪时，电转程序选自以下任一程序：

1）电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；

2）电压1750-1850v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；

3）电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；

4）电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述碱基编辑系统包括I）融合蛋白或其变体或编码融合蛋白或其变体的核苷酸；II）引导核苷酸。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述碱基编辑系统中引导核苷酸与融合蛋白或其变体的质量比为1：2-1：20。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述质量比1：4-1：6。

12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白或其变体的N端至C端依次连接第一nCas9片段、脱氨酶片段和第二nCas9片段。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，第一nCas9片段的氨基酸序列如SEQID NO. 39所示；和/或，第二nCas9片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述脱氨酶片段为胞嘧啶脱氨酶片段或腺嘌呤脱氨酶片段。