[发明专利]一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法

说明书

本发明公开了一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法。所述胶原多肽rhC17ICD的氨基酸序列由人17型胶原的胞内区（ICD）氨基酸序列组成或包含ICD区氨基酸序列，包括与人17型胶原98%序列同源性，并且同人17型胶原单链全长占比达30.73%。本发明通过大肠杆菌系统实现了人17型胶原ICD区的高效稳定表达，并且通过提供的纯化方法可获得纯度达到90%以上的目的蛋白，克服了对人17型胶原ICD区重组高效表达的局限性和产物稳定性差、易降解等问题。所述胶原多肽富含脯氨酸和赖氨酸，有利于形成三螺旋结构和天然胶原蛋白构象。本发明制备的胶原多肽rhC17ICD具有促细胞集落形成、油脂分泌以及促细胞黏附和迁移等生物学活性。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说，涉及一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法。

背景技术

胶原（collagen）是机体组织基质和支架的重要组成成分，起着保护并连结各种组织的重要作用。人XVII型胶原（Col17a1）由三条相同的α1链构成的均相三聚体，其中包含有50 kDa的球状胞内结构域（intracellular domain, ICD），一个跨膜域和120 kDa的胞外结构域。研究表明Col17a1是表皮干细胞半桥粒的重要组成成分，是毛囊干细胞以及皮肤干细胞稳态调节的重要成分，对基底膜粘附、皮肤衰老机制及毛囊干细胞维持具有重要作用，是未来抗衰和防脱类护肤品研究的一个有潜力的关注点。

胶原蛋白因其优异的生物学功能、生物相容性和生物可降解等特性，成为生物材料和再生医学等领域广泛使用的蛋白质材料之一。但由于人胶原结构的复杂性和现有研究的局限性，限制了人胶原的生产制备。目前市面上广泛使用的胶原材料主要是来源于动物组织提取获得的各种不同类型胶原，但存在人体吸收利用率低，免疫和病毒感染等生物安全性问题。

重组胶原可避免潜在的提取自异源机体胶原带来的疾病感染风险，同时可通过氨基酸序列优化提高胶原多肽的亲水性、稳定性，优化胶原分子量，提高胶原产品同源性、透皮吸收性和安全性。Col17a1属于跨膜类胶原，蛋白分子量大，结构高度复杂，难以分泌于胞外且容易降解。现有专利主要以Col17a1胞外区序列为主，通过序列选取、串联和氨基酸优化实现重组胶原的异源表达。而相对于胞外区，关于ICD的功能研究则很少。

重组单链结构胶原具有更多的活性结合位点，即便是三螺旋结构的重组胶原蛋白也会比天然人组织胶原结构更为松散，暴露出更多生物活性区域，易于与细胞或其他生物活性分子间发生相互作用，在许多方面可能表现出更强的生物活性。ICD序列具有特异性，可与整合素β4、网蛋白以及BP230相互作用。胞外域包括15个胶原蛋白区域，此区域由 Gly-X-Y 重复序列组成，胞外域主要通过与配体蛋白整合素α6和层粘连蛋白332相互作用。由于胞外域活性位点多且分布广、可溶性强，且易于表达和分泌，成为目前重组人17型胶原研发的主要对象，而鲜有对ICD的重组表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术对人17型胶原异源重组表达技术存在的不足，主要是克服重组人17型胶原长序列选取及胞内区即ICD区序列异源高效表达的问题。为此，本发明提供一种重组人源化17型胶原多肽（rhC17ICD）、编码该多肽的核苷酸序列和氨基酸序列、含有编码该多肽的重组表达质粒、工程菌、生产该胶原多肽的方法。基于本发明方法可实现rhC17ICD在大肠杆菌中高效表达，并具有促细胞集落形成、油脂分泌、黏附和迁移活性等生物学活性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组人源化17型胶原多肽，选自：

（1）人17型胶原的胞内区氨基酸，胞内区氨基酸序列如SEQ ID NO.2部分所示；

（2）包含有人17型胶原的胞内区氨基酸的序列；

（3））对SEQ ID NO.2进行氨基酸序列优化，选择序列中脯氨酸含量为5.4%，赖氨酸含量为6.3%，富含(G-X-Y)n的结构，其中G为Gly，X代表Pro，Y代表Lys，n代表多次重复。