[发明专利]一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片

说明书

本发明涉及微流控芯片技术领域，公开了一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，包括从上到下依次叠置的上层、中间层和下层；上层上设置有细胞悬液灌流通道；细胞悬液灌流通道两端分别设置有第一进液口和第一出液口；下层对应细胞悬液灌流通道位置设置有白细胞趋化分离区和CTC趋化捕获区；中间层包括第一PET膜和第二PET膜；第一PET膜设置于白细胞趋化分离区对应位置，第二PET膜设置于CTC趋化捕获区对应位置；本发明能够无标记的捕获外周血中高侵袭性的CTC，可用于临床肿瘤药物筛选，能够筛选出对肿瘤转移更有针对性的治疗药物。

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片。

背景技术

循环肿瘤细胞CTC是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。由于CTC在进入外周血后大部分会发生凋亡或被吞噬，因此目前获取外周血中的CTC主要用于肿瘤的检测。CTC通常被认定为表达上皮标记细胞角蛋白CK、上皮细胞粘附分子EpCAM但不表达CD45的有核细胞。但是，当前通过识别上皮特异性标记物捕获CTC技术的缺点是没法检测经上皮-间质转化EMT后不再过表达EpCAM的CTC。

现有的分离CTC的方法主要有：1）肿瘤标志物的磁珠分选（包括EpCAM，CK8、CK18、CK19等）；2）免疫细胞CD45标志物磁珠分选、负筛、分离免疫细胞；3）密度梯度离心方法：需要的血液量大，杂质多；4）过滤：可能损失较小的肿瘤细胞，还需根据肿瘤的不同制定不同的滤膜，生产要求高；5）特殊的仪器装置：门槛高、价格昂贵。目前，使用现有筛选方法的CTC难以在体外生长，其中一个可能的原因是使用细胞表面标记物（EpCAM）捕获CTC会阻碍后续细胞培养中的细胞粘附和增殖。而使用物理方法如离心、过滤等也可能会对细胞造成物理损伤。假设在不阻断细胞表面标记的情况下捕获CTC，可能是体外扩增细胞并保持捕获的CTC表型的可靠方法。近年来CTC检测技术不断发展，由于不同的富集和检测方法，在临床实践中CTC的检测方法尚未标准化，其主要应用仍局限于简单的计数与肿瘤转移能力的判断。

在外周血中的CTC中具有少量侵袭性较高的CTC，这一类群的CTC在外周血循环过程中更容易被特定环境所吸引，进而产生贴附和浸润，最终形成远端转移。如果能够针对此类群的CTC进行有效的捕获，培养，并用于体外抗癌药物的药敏测试，则有望能够筛选出对肿瘤转移更有针对性的治疗药物，这对于肿瘤患者治疗具有极为重要的意义。

目前基于微流控芯片方法对CTC的分离也有一定的研究，较为常见的策略是采用物理的方式；许多研究强调了CTC的物理和生物力学特性，使其能够与其他血细胞区分开来。大多数CTC的尺寸（17～52 μm）与红细胞（6～8 μm）和白细胞相比（大多数为7～15 μm，单核细胞为20 μm）更大，核质比更高，膜折叠复杂。可以通过采用不同孔径的滤膜或在芯片中设置间距不同的微柱阵列从血液中分离CTC。但是这种方法在处理大量细胞时存在易堵塞的问题。同时，其分离得到的CTC纯度较低。当流速控制不当时，还会对细胞造成物理损伤。此方法仅适用于分选CTC，不能用于分选高侵袭性的CTC。采用微流控芯片的方法对CTC分离的另一策略是采用生物学的方式，多采用抗原和抗体亲和性，针对CTC表面的特有标志物（如EpCAM等），在微流控芯片的流道表面修饰特异性抗体，在细胞悬液经过流道时，CTC会与抗体发生特异性结合，从而捕获CTC。另一种思路是分别将CTC特异性抗体（如EpCAM等）、白细胞特异性抗体（如CD45等）与磁珠相结合，制成免疫磁珠，免疫磁珠会分别与CTC、白细胞发生特异性结合，再通过磁场两级的吸附与排斥将结合CTC的免疫磁珠吸附，将结合白细胞的磁珠分离，即可实现对CTC的捕获。但是这种方法修饰的抗体总量是一定的，当处理的细胞量超出抗体总量时，存在部分细胞无法与抗体结合，造成丢失。因此处理样本的通量往往较低，而免疫磁珠法则需要对处理样品进行免疫磁珠的预标记。但是捕获的CTC均带有特异性抗体，无法实现对CTC的无标记捕获，对CTC的下游分析带来困难。同时这种方法也只能捕获CTC，无法分选出高侵袭性的CTC。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题提供一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片。