[发明专利]一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及在D-苯甘氨酸合成中的应用

说明书

本发明涉及二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其在D‑苯甘氨酸合成中的应用。本发明公开了一种由热玉米芽孢杆菌(Bacillus thermozeamaize)二氨基庚二酸脱氢酶通过分子改造而成的二氨基庚二酸脱氢酶突变体，编码所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体；以及所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体在不对称还原胺化苯甲酰甲酸合成D‑苯甘氨酸中的用途。与其他D‑苯甘氨酸合成方法相比，本发明的路线简单、理论得率高、原子经济性好、底物浓度和产品得率高，产物光学纯度大于99％。因此，属于一种环境友好、立体选择性高、绿色环保的生物合成方法，在D‑苯甘氨酸的实际生产中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种热玉米芽孢杆菌(Bacillusthermozeamaize)来源的二氨基庚二酸脱氢酶通过分子改造获得的具有D-氨基酸脱氢酶活性的二氨基庚二酸脱氢酶突变体，编码所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶催化剂的制备，以及所述突变体酶催化剂在催化苯甲酰甲酸不对称还原胺化制备D-苯甘氨酸中的应用。

背景技术

自然界中绝大多数生物化学合成砌块均为手性分子，它们就像鞋子、螺丝钉和蜗牛壳一样不能与其镜像重合。虽然手性分子有两种构型，但是大自然一般只选择其中一种作为合成砌块，例如只有L-氨基酸被用于合成蛋白质。大自然的这一选择赋予了D-氨基酸在其它特殊用途中作为完美的合成砌块的巨大潜能，比如，D-氨基酸已成为β-内酰胺抗生素、生育药物、抗凝血药和杀虫剂等药物的关键手性砌块。因为绝大多数酶蛋白经过亿万年的自然进化后，只能选择性地降解由L-氨基酸组成的物质，而对由D-氨基酸组成的物质则无降解作用。因此，由D-氨基酸合成的药物不仅具有更好的药效，而且在体内具有更好的稳定性，应用前景广阔。例如，D-苯甘氨酸是半合成抗生素氨苄青霉素的关键前体，其全球年需求量高达近万吨。

虽然，目前已经有多种化学合成手性氨基酸的方法被开发出来，但是，这些方法往往需要使用一些昂贵的金属催化剂，反应条件苛刻，合成路线比较复杂，得率和选择性比较低，远远无法满足医药领域日益增加的对手性氨基酸的需求。相反地，生物催化过程具有绿色环保、催化效率高、选择性好、反应条件温和等优点，是替代或拓展传统化学合成方法的重要手段，甚至已发展成为合成一些结构复杂或具有多个手性中心化合物的第一选择。

1998年，日本Kaneka公司利用N-氨基甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶对N-氨基甲酰基-D-苯甘氨酸进行水解合成D-苯甘氨酸(Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry1998,62:875-881)，该方法不仅理论得率低，而且原料不易获得，限制了其应用和推广。同年，意大利维罗纳大学Righetti教授课题组利用青霉素G酰化酶对D,L-苯甘氨酸消旋体进行动力学拆分，在该合成方法中青霉素G酰化酶能够以对羟基苯乙酸甲酯为酰化试剂对L-苯甘氨酸进行对映选择性酰化，从而获得D-苯甘氨酸(Biotechnology andBioengineering 1998,60:454-461)。2000年，意大利的里雅斯特大学的Gardossi教授则首次报道了利用青霉素G酰化酶在纯有机溶剂中对D,L-苯甘氨酸甲酯进行动力学拆分合成D-苯甘氨酸甲酯，其中青霉素G酰化酶能够对映选择性地对L-苯甘氨酸甲酯的氨基进行酰化，而对D-苯甘氨酸甲酯则没有酰化活性，从而达到将两个对映异构体拆分的目的(Tetrahedron:Asymmetry2000,11:1789-1796)。不过以上两种方法的局限性在于理论得率仅为50％，而且需要预先对苯甘氨酸的羧基进行保护，步骤比较繁琐。2014年，华东理工大学魏东芝教授课题组利用腈水解酶对苯甘氨酸腈进行动态动力学拆分合成D-苯甘氨酸，该方法虽然可以突破动力学拆分50％理论得率的限制，但是该路线涉及到的原料是剧毒的氰化物，不够绿色环保，而且产物的光学纯度也不够理想，低于97％ee(TetrahedronLett.2014,55:1448-1451)。