[发明专利]一种高效的玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法

说明书

本发明公开了一种高效的玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法，所述原生质体悬液的制备方法，包括如下步骤：1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行质壁分离预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L‑半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。本发明的方法制备的原生质体悬浮液中的细胞碎片等杂质得到有效清除，且获得原生质体质量较高，达到单细胞测序的要求。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的说，涉及一种原生质体悬液的制备方法，尤其是玉米根尖病原菌侵染的原生质体的制备方法。

背景技术

细胞是构成植物机体的基本功能单元。基于细胞的增殖、分化和生长，细胞从原初细胞逐渐分化形成具有不同功能的特化细胞、组织和器官，该过程本质是具有相同遗传物质的细胞进行基因差异表达的结果(刘德培等,1994)。为了揭示细胞基因选择性表达的调控机理，现代生物技术的发展使对特定部位或特定时期细胞进行单细胞测序成为可能。然而建立不同类型细胞的基因表达谱首先要将不同类型的细胞群体分开，以收集足够数目的单一类型细胞进行转录组测序。目前，单一类型细胞分离主要有两种形式(董燕等,2015)：一种是通过显微切割分离单个细胞，提取RNA并反转录为cDNA，然后进行扩增和测序。上述方法需要较为复杂的操作技术，某些寡拷贝基因难以在后续扩增和测序中进行检测。另一种方法是分离同一类型细胞进行测序，即通过流式细胞仪或者显微操作收集一定数量的单一类型细胞，然后进行RNA提取和测序。Bimbaum等(2005)以不同部位特定表达的基因为标记，通过流式分选的方法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)根不同层的细胞进行分离和测序。在玉米根细胞生长、分裂、分化过程中，玉米根尖细胞中的基因选择性表达，使得根原细胞分化成为根冠细胞、分生区细胞、伸长区细胞和成熟区细胞(Sánchez et al.,2018)。为探究基因表达对根尖细胞命运决定的影响，需要将上述4种类型的细胞分群，以进行更深入的分析。而且原生质体不仅是原生质体培养和融合的基础，还可作为一个单细胞系统而用于研究细胞的生长发育过程，包括细胞壁再生、细胞分裂和分化等(Zhou等,2005)。此外，原生质体还可作为体细胞杂交、基因工程等理论研究的基础材料，进行导入外源基因、病毒侵染等操作(Reddy等,2006)。而获取的单细胞的质量和数量直接影响着后续实验的开展及实验结果的可靠性，植物由于细胞壁的存在，分离出大量高质量单细胞较困难，因此迫切需要一种高效的获取大量、高质量单细胞的方法。目前，拟南芥和烟草叶片单细胞的制备方法比较成熟，而玉米等其他植物的单细胞制备方法相对滞后。制备单细胞的材料一般为代谢活跃的组织或器官，如幼茎、叶鞘、叶片、根尖、根毛、子叶、胚轴、愈伤组织、体细胞胚等。

发明内容

为了提高玉米根尖病原菌侵染效率，降低玉米根尖原生质体制备的试验成本，缩短制备时间，提高制备玉米根尖原生质体的数量和活性。本发明提供一种能够高效制备玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法。

本发明提供一种原生质体悬液的制备方法，包括如下步骤：

1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；

2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；

3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。

其中，所述步骤1中的预处理液中L-半胱氨酸的的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。