[发明专利]一种高效的玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法

权利要求书

1.原生质体悬液的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：

1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行质壁分离预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；

2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；

3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述步骤1中的预处理液中L-半胱氨酸的的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。

3.根据权利要求2中的方法，其特征在于，所述步骤1中预处理条件为将1g植物器官，转移到预处理液中，用铝箔纸包严以避光，置于22℃摇床35rpm/min处理50min使根尖细胞发生质壁分离；其中植物器官与预处理液的用量比为每1g植物器官：5mL预处理液。

4.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述酶解液中纤维素酶的的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml、离析酶的浓度为0.005g/ml。

5.根据权利要求4中的方法，其特征在于，所述步骤2中酶解条件为将切片的植物器官放入酶解液中，铝箔纸包严后置于摇床22℃，35rpm/min，酶解150min～180min。

6.根据权利要求5中的方法，其特征在于，所述步骤3包括：

31)使用W5溶液两次润洗原生质体的粗提液，离心，吸去上清，除掉W5溶液；

32)使用PBS重悬细胞至少一次；

33)使用PBS润洗的细胞过滤筛过滤重悬后的细胞。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，植物器官为植物根尖，所述切片为从根尖向上的5mm进行切片，每片厚度为0.5mm。

8.一种用于原生质体的分离的组合物，其特征在于，所述组合包括预处理液和酶解液；所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述预处理液中L-半胱氨酸的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。

10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述酶解液中纤维素酶的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml，离析酶的浓度为0.005g/ml。