[发明专利]检测游离B细胞刺激因子的方法

说明书

本申请涉及检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。

技术领域

本申请涉及检测游离B细胞刺激因子的方法及其应用。

背景技术

B细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）主要表达于髓系细胞表面，其为同源三聚化的II型穿膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族；通常胞外区部分在蛋白酶作用下发生水解，形成可溶性BLyS。

新药研发过程中，机体和药物的相互作用，需要了解药物和疗效、药物与靶标的结合率以及毒性之前的关系。建立监测游离BLyS浓度随靶向BLyS新药给药后的变化情况，为建立药效模型奠定数据基础至关重要。

通过调研现有的检测BLyS的方法，目前无任何一个方法可以检测机体在给予针对不同的靶向BLyS新药后，体内游离BLyS浓度的变化趋势。建立一个通用的检测游离BLyS方法可以加速新药上市进程，同时也能为新药研究过程中，找到无创性生物标志物即药效指标提供依据。

目前本领域的难点在于如何能检测到游离的Blys。

发明内容

第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b.在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。

在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。

在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。

在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入AssayDiluent RD1-111以封板。

在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。

在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。

在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。

在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。

第二方面，本申请提供了检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。

在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。

在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。