[发明专利]一种黄颡鱼头肾成纤维细胞传代培养方法

说明书

本发明公开了一种黄颡鱼头肾成纤维细胞传代培养方法，该方法包括以下步骤：(1)选取健康的黄颡鱼，取样前饥饿24小时；(2)对黄颡鱼进行静脉取血，所得血液静置至析出血清，将血清离心过滤后冻存备用；(3)对静脉取血后的黄颡鱼进行解剖，将获得的头肾组织进行消化；(4)制备完全培养液；(5)细胞原代培养；(6)细胞传代培养。本发明培养方法简单，材料易获取，成功培养了黄颡鱼的头肾细胞，传代后细胞呈成纤维样；本发明利用黄颡鱼同源血清，首次在体外成功培养了连续传代的黄颡鱼头肾细胞，细胞形态好、存活时间长，可以大量提供黄颡鱼头肾细胞，可应用于黄颡鱼免疫和病害基因功能等方面的研究。

技术领域

本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种黄颡鱼头肾成纤维细胞传代培养方法。

背景技术

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，别名昂刺鱼、黄姑子和黄辣丁等，广泛分布在我国的河流和湖泊，是我国优质淡水养殖经济鱼类。随着集约化养殖规模和不断增加，各种病害问题频繁发生，严重危害了黄颡鱼产业的可持续发展。近年来，黄颡鱼病害的分子机制研究不断加深，黄颡鱼细胞系的缺乏成为了限制病害等研究的绊脚石。因此，通过建立黄颡鱼原代细胞，摸索细胞体外生长和传代的条件，并在此基础上建立细胞系，已成为黄颡鱼产业高质量健康发展当务之急。

头肾作为鱼类的重要免疫器官，是许多鱼类免疫学研究中细胞材料来源的首选组织。目前还没有黄颡鱼头肾细胞系或传代培养方法的报道。中国专利CN115141791A公开了一种黄颡鱼原代肾细胞分离及培养方法，该方法获得的细胞为原代肾细胞，但其存活时间短，且未进行传代培养。本专利经过对培养方法的不断改进和反复试验，摸索出一套稳定的黄颡鱼头肾成纤维细胞传代培养的方法。本方法培养的细胞存活时间长，细胞形态佳，对黄颡鱼头肾细胞系的建立有重要借鉴意义，可用于黄颡鱼免疫和病害等方面的研究。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种黄颡鱼头肾成纤维细胞培养方法，该方法首次在体外成功培养了连续传代的黄颡鱼头肾细胞，细胞形态好、存活时间长，可以大量提供黄颡鱼头肾细胞，可应用于黄颡鱼免疫和病害基因功能等方面的研究。

技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种黄颡鱼头肾成纤维细胞传代培养方法，包括以下步骤：

(1)黄颡鱼的选取：选取健康的黄颡鱼，取样前饥饿24小时；

(2)黄颡鱼血清的获取：对黄颡鱼进行静脉取血，所得血液静置至析出血清，将血清离心过滤后冻存备用；

(3)头肾组织的分离：对静脉取血后的黄颡鱼进行解剖，将获得的头肾组织进行消化；

(4)配制完全培养液：以RPMI 1640培养基为基础，再分别加入胎牛血清、双抗溶液、黄颡鱼血清；

(5)原代培养：利用细胞培养液冲洗步骤(3)组织液，终止消化后离心收集细胞，重悬于完全培养液后置于培养箱培养；

(6)传代培养：待头肾细胞出现成长梭形可进行传代培养，使用胰酶进行消化，消化后离心收集细胞，置于培养箱传代培养。

进一步地，所述步骤(1)中的黄颡鱼为商品规格鱼，体长16±5cm，体重为180±20g。

进一步地，所述步骤(2)中所得黄颡鱼血液在室温静置2～3小时后自然析出血清。

进一步地，步骤(3)中所述消化过程是将黄颡鱼头肾组织进行物理剪碎，再置于胰酶中进行消化，所述胰酶浓度为0.25％(w/v)。

进一步地，所述步骤(3)消化是在金属浴28℃下消化15-20min。