[发明专利]一种基于LC-MS对On-DNA化学反应中DNA损伤的分析方法

说明书

本申请涉及DNA编码化合物库领域，具体公开了一种基于LC‑MS对On‑DNA化学反应中DNA损伤的分析方法。该分析方法包括：选取内参样品和标准品，配制一组含有标准品与内参样品的标准液；将标准液进行LC‑MS分析，以标准品与内参样品的摩尔比为横坐标，以检测信号响应比值为纵坐标，得到标准工作曲线；利用内参样品进行On‑DNA化学反应后得到待测样品液，再与标准品混合后，进行LC‑MS分析，计算内参样品的回收率，并判断DNA损伤情况。该分析方法通过LC‑MS提供的样品分子量和信号强度的改变，可以在一天内完成对数百种反应类型的DNA损伤鉴定，这对于DEL文库的后期筛选及高通量分析有重要意义。

技术领域

本申请涉及DNA编码化合物库技术领域，更具体地说，它涉及一种基于LC-MS对On-DNA化学反应中DNA损伤的分析方法。

背景技术

DNA编码库(DELs)最初是由Brenner和Lerner于1992年提出的概念，目前在早期药物筛选发现中已经成为一个重要的识别工具。DELs每个分子上都有独特的DNA标签，可以快速、并行地筛选数百万至数百亿种化合物。近年来，构建DEL文库的合成方法(也称On-DNA化学反应)发展迅速，现在已经开发了来自有机化学的广泛反应。然而，随着反应类型的增多，与DNA的副反应也在不断发生。作为DNA序列编码多样性的一部分，修饰的碱基可能导致包括突变、移位、断裂等在内的各种DNA损伤，最终导致可扩增编码DNA的显著损失，造成后期PCR过程的中止，从而降低表观DNA浓度并对信号产生负面影响。

人们已经开发了几种方法来量化化学反应引起的部分DNA损伤，大多数传统的检测DNA损伤的方法要么是全局的、与序列无关的方式，要么局限于一种或几种确定的DNA损伤类型。比如目前较为公认的Sanger测序和qPCR。

Sanger测序是指在DNA复制过程中加入双脱氧核甘三磷酸(ddNTP)产生一系列末端终止的DNA链，通过电泳和相应仪器可以读出DNA长度和序列。Sanger测序可以报告显著的点突变，但它不能量化不太频繁的点突变，因此不适用于DNA序列仅几十bp的DEL文库。

qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。但该方法有很大劣势，比如：1.qPCR需要在起始阶段对标准品和样品的浓度归一。但是样品在化学反应后产生损伤，分子量可能发生改变，因此样品往往是混合物，无法准确测量其浓度。2.qPCR的扩增效率和特异性与很多因素有关(引物，扩增温度，扩增子长度等)，因此qPCR在实践中往往需要耗费大量的人力物力来优化程序，这对于动辄几百种的DNA化学反应是不合适的，其需要大量的劳动来确定单个样本的扩增效率和标准化程序，并不适合高通量分析。3.qPCR仅提供一个相对的回收率，无法分析具体的DNA损伤类型，比如扩增子中经常发生单个或多个碱基的突变，但这并不影响qPCR的扩增。

鉴于此，现在急需一种能够快速、准确的量化化学反应引起的部分DNA损伤的分析方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本申请提供一种基于LC-MS对On-DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其通过LC-MS进行检测分析，可通过外标法快速计算On-DNA化合物回收率，同时由于内参样品和标准品都不参与任何化学反应，因此通过LC-MS提供的样品分子量和信号强度的改变，可以在一天内完成对数百种反应类型的DNA损伤鉴定，这对于DEL文库的后期筛选及高通量分析有重要意义。

本申请采用如下的技术方案：

第一方面，本申请提供一种基于LC-MS对On-DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其包括：

选取用于进行On-DNA化学反应的DNA标签，作为内参样品；

选择特定的DNA片段作为标准品，且标准品的LC-MS图谱与内参样品的LC-MS图谱中的检测信号响应不重合；