[发明专利]一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用

说明书

本发明公开一种评估零模波导孔有效载样的方法，包括：制备酶‑引物‑模板三元复合物；将三元复合物和芯片绑定；对芯片进行荧光淬灭，找到具有单个荧光的孔；对芯片进行荧光累积，找到荧光能够持续累积的孔；确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔。本发明还公开了上述方法的应用。本发明构建了一种评估零模波导孔有效载样的方法，使用一种简单的酶‑引物‑模板三元复合物作为研究模型，利用荧光淬灭和荧光累积的过程进行双重判定，有利于更精准地筛选出单分子实时测序的有效载样孔。同时，还能够用于整个测序体系的优化，通过调整来优化有效载样率。

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用。

背景技术

科学家们对于遗传物质的早期探索是艰难而又缓慢的，从发现遗传物质的存在，到确认DNA是遗传物质并提出DNA双螺旋模型，经历了近一个世纪的探索。19世纪60年代，孟德尔提出分离定律和自由组合定律；直到1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋模型，人们才对DNA的形态才有了初步的认知。而在这之后，对于DNA的研究进入了飞速发展的阶段。1987年启动的人类基因组计划，完成了30亿个碱基对的测序，总共花了6个国家13年的时间。而2023年的今天，一个完整的基因组测序，从采样到测序到分析，只需要花费一周的时间。这一切，都得益于基因测序技术的诞生和迭代。

自从20世纪70年代一代测序技术问世以来，基因测序技术在几十年间不断发展，已经形成了各具特色的几代测序方法。其中一代测序有两种代表性的方法，分别是链终止法，也常被称为Sanger测序法，以及化学裂解法。一代测序的准确率可达99.999％，一次可以读取600-1000bp左右的碱基，直到现在，仍然是行业内的金标准，但一代测序的通量低，成本高。这也促进了二代测序的诞生，二代测序以大规模高通量平行测序为主要特征，准确率能够超过99.9％，高通量使得DNA的测序成本大幅下降，研究显示，2007年至2012年，DNA测序单个碱基的原始成本下降了四个数量级。罗氏、Illimina、赛默飞等二代测序公司展开了激烈的竞争，成本的下降及商业上的推广使得二代测序成为当前市场上的主流使用方法。但同时由于二代测序读长短，且需要进行模板扩增，所以在过程中会引入复制错误、酶的偏好性、GC bias、算法的偏好性等系统性偏差，使得二代测序对于一些结构变异、重复性序列等信息的检测准确性不够。而三代测序则能够很好地处理这些问题。三代测序以单分子测序为主要特征，读长可达100kb，逐渐成为当前研究的热点以及未来测序发展的主要趋势。三代测序主要分为纳米孔测序技术和单分子实时测序技术(SMRT)；单分子实时测序技术(SMRT)是三代测序中应用比较广泛且已经大规模商业化的核心技术。

SMRT测序技术的核心在于使用磷酸位标记的dNTP搭配直径在50-200nm的零模波导孔(ZMW)形成分散在各个孔内的单分子荧光，利用单分子荧光实时显示DNA聚合的反应过程，再使用单分子荧光成像系统进行观察、捕获和分析。在这个过程中有效载样是实现单分子实时测序的必要条件，有效载样率及ZMW数量决定了测序通量。为了保证测序过程的顺利进行，进孔的样本需要同时满足以下几个条件：

(1)孔内含有酶-引物-模板三元复合物，而不仅仅是单个酶分子、单个引物分子、单个引物-模板二元复合物分子；

(2)单个酶-引物-模板三元复合物进孔且固定在孔底，而不是空的孔、双复合物分子孔或多复合物分子孔；

(3)整体过程中保证酶活性，确保后续滚环复制顺利进行。