[发明专利]一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用

权利要求书

1.一种评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：制备酶-引物-模板三元复合物；

S2：将三元复合物和芯片绑定；

S3:对芯片进行荧光淬灭，并对荧光淬灭过程进行拍摄，找到具有单个荧光的孔；

S4：添加启动试剂，启动聚合反应，对芯片进行荧光累积，并对荧光累积结果进行拍摄，找到荧光能够持续累积的孔；

S5：确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔。

2.根据权利要求1所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中的酶-引物-模板三元复合物中所述模板为单链环形模板，具体制备方法包括：

合成长度50～140nt的单链DNA模板，序列中A、T、C、G四种碱基中的一种碱基的数量只有一个，其余碱基的数量大于一；

使用环化酶或T4 DNA连接酶对所述单链DNA模板进行环化，并进行纯化，得到所述单链环形模板。

3.根据权利要求1或2所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中，酶-引物-模板三元复合物的制备方法为将单链环形模板与带有荧光和固定基团的引物进行退火处理，形成引物-环形模板复合物；然后添加phi29聚合酶孵育得到所述酶-引物-模板三元复合物。

4.根据权利要求3所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，

所述引物上的固定基团包括但不限于生物素、链霉亲和素、氨基中的至少一种；

荧光包括但不限于香豆素系列的染料、荧光素系列染料、Alexa Fluor系列染料、Cy系列染料、罗丹明系列染料、德州红Texas Red或硅基罗丹明SiR中的至少一种。

5.根据权利要求1-4任一项所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，

步骤S2中，将芯片经钝化处理后，在孔内玻璃表面修饰氨基、链霉亲和素或生物素中的一种，将步骤S1得到的三元复合物添加在芯片中孵育固定；

所述芯片为孔径80～200nm，孔间距5～15μm的零模波导芯片，每个芯片上零模波导孔数量为2000～150000个。

6.根据权利要求1-5任一项所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，所述步骤S3为，将芯片清洗后用油密封，然后在引物所带荧光对应的光源下拍摄，以1～100帧/s的帧率进行连续拍摄，记录每个孔的荧光值变化曲线，根据荧光淬灭的形态挑选出只有一个荧光的孔。

7.根据权利要求1-6任一项所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，所述步骤S4为，向芯片中添加启动试剂启动滚环复制，在黑暗中反应后清洗，然后在启动试剂荧光对应的光源下拍摄，光源不限于紫外灯、汞灯、LED、激光等；带荧光对应的光源下拍摄，以1～100帧/s的帧率进行连续拍摄，记录每个孔的荧光值变化曲线，挑选出荧光能够累积的孔；

所述启动试剂中的四种dNTP中，有一种dNTP带有荧光，其余三种dNTP不带有荧光；

带有荧光的dNTP与模板中只含有一个的碱基互补配对。

8.权利要求1-7任一项所述的评估零模波导孔有效载样的方法在单分子实时测序方法的应用。