[发明专利]特异性靶向猪Pax3基因的sgRNA序列及其应用

说明书

本发明公开了特异性靶向猪Pax3基因的sgRNA序列及其应用，属于动物基因工程技术领域。本发明的特异性靶向猪Pax3基因的sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将其与Crispr‑Cas9系统相结合，使其在目的基因位点处产生双链断裂，从而能够通过非同源末端修复机制造成Pax3基因起始密码子ATG附近的碱基随机缺失或插入，进而导致猪Pax3基因表达被沉默，以研究Pax3基因缺失对猪自身生长发育的影响；还可以通过同源重组，将外源基因插入基因组目标位点，从而在Pax3基因目标位点处实现精准高效的基因编辑。本发明为深入研究Pax3基因在猪生长发育过程中的具体作用机制及制备Pax3转基因猪提供一个简单可行的方法。

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，具体涉及特异性靶向猪Pax3基因的sgRNA序列及其应用。

背景技术

在过去的几年中，Crispr-Cas9技术的发现彻底改变了现代生物学的研究速度，预示着即将进入疾病检测治疗和新兴生物技术开发的新时代。此技术可以通过在几乎任何生物体或细胞类型中产生定点靶向双链断裂来实现基因编辑。这种方法由两个关键成分组成：Cas9，一种在指定位置诱导DNA中双链断裂(DSB)的内切酶；以及sgRNA，它将Cas9蛋白引导到预期靶标位点，并确保基因组编辑的精确度和特异性。在实验室应用中，Crispr-Cas9技术需要通过创建符合需要的sgRNA序列来鉴定和切割特定DNA目标位点。然后Cas9蛋白会扫描基因组，以寻找靶基因组中的PAM区域。当Cas9-sgRNA复合物结合时，它将识别DNA与sgRNA的特异性，并导致PAM区域之前3bp处位点特异性双链断裂产生平末端。这些双链断裂的DNA随后可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。Crispr-Cas9技术的快速发展反映了它的实用性、简单性和有效性，它的使用已经发展至序列特异性基因表达调控和各种平台的全基因组突变筛选等多个方面。这些新的方法学进步大大拓宽了研究各种动物和疾病的基因功能和建模的技术选择。

Paired Box3(Pax3)是转录因子PAX家族中成员之一，该家族对胎儿发育和癌症生长方面有很重要的作用。Pax3在许多不同组织的发育过程中发挥重要作用，可以调节神经嵴，并与其直系同源物Pax7一起在中枢神经系统的部分区域表达。Pax3是肌生成的关键调节因子，在胚胎早期骨骼肌形成过程中起主要作用。目前有关Pax3的研究主要集中在小鼠中，在猪等哺乳动物的研究还比较少。已有文献证明，Pax3的表达量在很大程度上影响猪肉的肉质，但其具体机制尚未明确，急需合适的动物模型进行深入研究，进而提高肉猪的生产性能。通过利用Crispr-Cas9系统，最终可以获得Pax3基因敲除或是追踪的转基因猪以供实验研究，而首要步骤都是找到能够特异性靶向Pax3启动子的sgRNA，通过sgRNA与Crispr-Cas9系统结合使用，从而实现靶向编辑。

但目前还未见有特异性靶向猪Pax3基因的sgRNA序列的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一条特异性靶向猪Pax3基因启动子序列的sgRNA序列，以靶向沉默或修饰猪Pax3基因，更方便地产生并研究Pax3转基因猪，为制备转基因猪奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种特异性靶向猪Pax3基因起始密码子ATG的sgRNA靶标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的sgRNA靶标序列位于Pax3基因起始密码子ATG附近位置，具体如下：

序列中的粗体字为起始密码子。

该靶标序列的长度与位置由Pax3基因起始密码子及其周围PAM位点决定，包含起始密码子ATG及其周围5个PAM序列。根据此序列设计sgRNA可达到预期靶向沉默或修饰Pax3基因的目的。