[发明专利]一种新金色分枝杆菌重组表达载体及其应用

权利要求书

1.一种新金色分枝杆菌重组表达载体，其特征在于：由以下方法构建而成：

将启动子及核糖体结合位点序列片段插入载体骨架，并在所述载体骨架中连接甾体类化合物生物转化过程中相关酶的基因片段；

其中，所述启动子及核糖体结合位点序列片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6。

2.如权利要求1所述的一种新金色分支杆菌重组表达载体，其特征在于：所述载体骨架为质粒pMV306。

3.如权利要求1所述的一种新金色分支杆菌重组表达载体，其特征在于：所述甾体类化合物包括9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮、雄甾-4-烯-3,17-二酮、22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮、22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮、睾酮、宝丹酮。

4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有如权利要求1～3任一项所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为快速生长型分枝杆菌，包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为Mycobacteriumsp.NRRL B-3805。

7.一种如权利要求4～6任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)以新金色分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805为底盘菌，连续敲除kshA1、MnOpccR、Sal基因，得菌株Mn 3805△kMS；

(2)将如权利要求1～3任一项所述的重组表达载体电转导入菌株Mn 3805△kMS，得到所述基因工程菌。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述kshA1、MnOpccR、Sal基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求1～3任一项所述的重组表达载体、或如权利要求4～6任一项所述的基因工程菌、或如权利要求7～8任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在甾体类化合物生物转化过程中相关酶的过表达中的应用。

10.如权利要求1～3任一项所述的重组表达载体、或如权利要求4～6任一项所述的基因工程菌、或如权利要求7～8任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在甾体类化合物生产中的应用。