[发明专利]基于双荧光染料标记的适配体检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

本发明提供检测赭曲霉毒素A的探针，其特征在于，所述探针包括赭曲霉毒素A的适配体和两种荧光染料标记，所述荧光染料标记位于所述适配体的两端，所述适配体的序列为GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CT_x，其中X为选自0至10的整数，所述两种荧光染料标记在空间靠近时能够发生荧光共振能量转移。本发明还提供了赭曲霉毒素A的检测方法。这种检测方法具有诸多优点，在均相溶液中进行，不需要分离、不需要固定分子、检测快速、信号稳定、操作简单、灵敏度高等。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于双荧光染料标记的适配体检测赭曲霉毒素A的方法及使用的探针。

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是曲霉菌和青霉菌菌株等的次级代谢产物。赭曲霉毒素A可造成多种农作物(大麦、小麦、玉米、花生、燕麦等)、坚果、水果、食品、饲料和环境等的污染，OTA污染物广泛，相关OTA污染的事件经常发生。OTA可通过食物链进入人体或动物体内，对人类和动物产生健康危害，产生多方面的毒性，如肾毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性等。各个国家对很多食品中OTA的最大可接受水平都有严格的限量标准。灵敏检测赭曲霉毒素A对于食品安全、环境保护、质量控制、污染物筛查、人体健康等都具有重要的意义。目前常用的OTA检测方法往往依赖大型仪器如高效液相色谱、质谱等，这些仪器方法虽然具有定量准确等优势，但也有不少缺点例如仪器昂贵、需要专业的技术人员、操作步骤复杂、检测耗时、检测成本高等，不适用于快速现场检测。免疫分析技术也常用于OTA的检测，需要采用抗体作为识别分子，免疫抗体的筛选和制备需要动物等，价格昂贵，而且稳定性有局限。因此，低成本、快速、灵敏检测OTA具有很大的需求，但也面临挑战。

核酸适配体作为一种新型的亲和配体在分析传感领域显示出优势。核酸适配体可以从随机的核酸序列文库中筛选得到。适配体可通过化学的方法合成，容易制备，批间重现性好，多种功能团(如荧光染料)可修饰到适配体上。基于核酸适配体的检测技术在多个领域具有应用前景。利用高亲和力高选择性的赭曲霉毒素A的适配体可以发展新型的检测OTA的分析传感方法，如电化学传感、光学检测等，但不少基于适配体的OTA的方法仍存在一些局限，需要将适配体固定在电极表面或纳米材料表面、需要分离、检测时间长、步骤多、信号重现性差等。

因此，还需要改进的检测赭曲霉毒素A的方法。

发明内容

本发明构建了一种双荧光染料标记的适配体用于分析OTA。我们在可结合OTA的适配体序列的两端分别标记荧光素(FAM)染料和四甲基罗丹明(TMR)染料，作为检测OTA的荧光探针。检测OTA时，将适配体荧光探针与OTA温育，然后在FAM的激发波长下，测量FAM和TMR的荧光强度，采用TMR的荧光强度和FAM的荧光强度的比值(F_TMR/F_FAM)作为检测信号用于OTA的检测。所构建的荧光标记适配体与OTA结合前后，荧光强度比值检测信号(F_TMR/F_FAM)产生显著的变化，可实现检测OTA。这种比率型的荧光检测模式可克服单纯依赖荧光强度变化检测方法信号容易波动的局限。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：