[发明专利]能避免胚胎培养液中母源性污染的卵丘细胞去除液的制备方法

说明书

本发明提供一种能避免胚胎培养液中母源性污染的卵丘细胞去除液的制备方法，通过配制特定的囊胚培养卵丘细胞去除液，在人类胚胎体外发育时进行胚胎表面残余卵丘细胞脱除操作。卵丘细胞去除液由透明质酸钠、乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽和聚乙烯吡咯烷酮溶解于3‑吗啉丙磺酸缓冲液中配制而成。本发明提供的制备方法，是一种在囊胚培养过程中有效脱除残留卵丘细胞的方法，可高效分离胚胎与卵丘细胞，并且能保护胚胎，减少机械及氧化应激刺激，从而避免培养液中携带母源性污染DNA或RNA等遗传信息，有利于提高niPGT的准确性。可有效避免胚胎培养液中母源性卵丘细胞污染干扰培养液中基因检测结果的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人胚胎透明带上附着的卵丘细胞去除方案，具体涉及能避免胚胎培养液中母源性污染的卵丘细胞去除液的制备方法。

背景技术

近年来，随着体外受精胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术的发展和临床实践的改进，单胚胎移植策略逐渐得到推广和应用，从而降低了多胎率。单胚胎移植指在体外受精过程中只将一个优质的胚胎植入子宫，以降低多胎妊娠的风险。虽然选择性单胚胎移植已成为降低多胎发生风险的趋势。但由于产妇年龄的增加，流产率逐年上升。如何选择具有最佳发育潜能的可供优先移植的胚胎对于最大限度地提高成功怀孕的可能性至关重要。

既往对于优质胚胎的筛选往往通过形态学特征进行评估。然而，由于形态学特征不能完全反映胚胎的发育潜能，因此这种方法尚不能准确预测胚胎植入结局。相比之下，涉及侵入性操作的胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)被广泛用于胚胎的优选。该技术通过对卵裂期胚胎或囊胚滋养外胚层细胞进行活检和全基因组扩增，之后进行微阵列比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性(SNP)阵列和第二代测序(NGS)检测，从而对胚胎染色体进行评估，选择染色体正常的胚胎进行移植，以期提高单次移植胚胎的着床率和妊娠率改善妊娠结局。然而该方法亦存在不足：随机对照试验表明，在拥有三个或更多优质囊胚的女性中，传统IVF的累积活产率不劣于PGT-A患者。提示PGT-A并未明显改善累积活产结局。其次，另一项研究证实去除一个或多个细胞可能会导致胚胎发育潜能受损。且囊胚活检操作不当会导致着床率降低或产生人为的异常PGT结果。

因此，有必要通过非侵入性方法来评估胚胎质量与发育潜能。近些年来，利用胚胎培养液进行胚胎无创植入前遗传学检测技术(Non-invasive Preimplantation genetictesting,niPGT)的探索成为研究热点，可以不经活检，不对胚胎造成损伤而获得胚胎遗传信息，综合考虑移植质量最佳(发育形态良好，染色体整倍)的胚胎，从而改善IVF治疗的临床结局。

颗粒细胞(granulosa cell)是卵泡内的体细胞,在卵泡的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。随着卵泡发育至窦卵泡期,颗粒细胞分化为围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞(cumulus cell)和卵泡壁上的壁层颗粒细胞(mural granulosa cell)。卵丘细胞主要参与卵子成熟过程中的调节作用，与卵母细胞一起形成一个紧密的整体，促进卵子成熟和受精过程的发生。卵丘细胞和卵子结合紧密，使用常规方法很难将其完全从卵子表面脱除，继而在胚胎培养过程中持续残留在胚胎透明带表面。这种残留的微量卵丘细胞不对IVF-ET结局构成负面影响，因而临床胚胎培养中往往不对其进行特殊处理。

然而在进行niPGT时，若在囊胚培养过程中没有将包绕在胚胎上的卵丘细胞其完全去除，残存的卵丘细胞将会向培养液中持续释放DNA或RNA等遗传物质，从而造成核酸提取时母源性细胞污染，常导致检测异常。因此在进行胚胎培养液中DNA或RNA等核酸检测时必须将卵丘细胞全部去除才可避免母源性污染的发生。然而常规的卵丘细胞去除方法多使用透明质酸酶进行消化，并且依靠反复的机械抽吸使卵细细胞与胚胎分离。这种方法不能完成去除包绕在胚胎外的卵细细胞，且反复的机械抽吸容易导致胚胎出现机械应激和氧化应激，影响胚胎发育潜能，导致不良辅助生殖结局。

发明内容