[发明专利]一种BNP兔单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种BNP兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

通过抗原对免疫调节剂脂质体处理后的兔子进行免疫；

取免疫后兔子的脾脏细胞；

将脾脏细胞分离出的B细胞浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合；

筛选产生抗BNP抗体的优势兔鼠杂交瘤细胞株；

根据筛选出的优势兔鼠杂交瘤细胞株产生的抗体提取抗BNP抗体的RNA；

以该RNA为模板对抗体中重链、轻链可变区进行RT-PCR扩增，得到多个重链和轻链可变区基因；

将重链、轻链可变区基因分别通过同源重组克隆到含重链、轻链恒定区基因的pcDNA-R1表达载体中，转染到HEK293T细胞中进行表达，得BNP兔单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过抗原对免疫调节剂处理后的兔子进行免疫，包括：以纯化的人BNP融合蛋白为抗原对兔子进行免疫处理，免疫处理前采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理兔子。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为SAHA脂质体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述SAHA脂质体的粒径为120～180nm，SAHA脂质体是由SAHA包载到脂质体DSPE-PEG2000的亲水性囊包中制备成的。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将脾脏细胞分离出的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，包括：从获取免疫后的兔脾脏细胞分离出B细胞，使用抗兔CD138抗体对B细胞进行浆细胞筛选富集；将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0扩大培养使之处于对数生长期，取SP2/0细胞和浆细胞进行电击融合得到兔鼠杂交瘤细胞。

6.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，筛选产生抗BNP抗体的优势兔鼠杂交瘤细胞株，包括：兔鼠杂交瘤细胞加入DMEM培养基中，待细胞状态恢复后，加入含BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养基进行培养，待融合细胞成团时将单细胞克隆挑至铺有BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的HT培养液中培养，采用间接ELISA法筛选产生抗BNP抗体的优势杂交瘤细胞株。

7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以该RNA为模板对抗体中重链、轻链可变区进行RT-PCR扩增时，采用的重链可变区引物基因序列分别如下：

SEQ ID NO.01（HC-F1）：GTCGBTGRAGGAGTCCG

SEQ ID NO.02（HC-F2）：GGAGCAGYTGAAGGAGTC

SEQ ID NO.03（HC-F3）：GCAGCTGGAGCAGTCCG

SEQ ID NO.04（HC-G-F1）：ATGGAGACTGGGCTGCGCTGG

SEQ ID NO.05（HC-G-R1）：AGATCATGAGGGTGTCCTTG

SEQ ID NO.06（HC-G-R2）：GTGGGCACGTGGGCTTGCTG

SEQ ID NO.07（HC-M-R1）：GGGAAAGGACACTCGCA

SEQ ID NO.08（HC-M-R2）：GGACTTGCGTGTGCCAGA。