[发明专利]烟草转录因子NtbHLH68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用

说明书

本发明公开了一个烟草烟碱代谢相关转录因子基因NtbHLH68及其编码蛋白与应用。所述烟草转录因子NtbHLH68包含的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码蛋白质包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本申请通过对烟草NtbHLH68的RNAi干扰沉默，发现将NtbHLH68基因沉默后，和对照植株比，苗期干扰株系叶片中烟碱含量明显降低。利用这一特性，可为烟草低烟碱品种培育提供新的策略和路径。因此，烟草转录因子NtbHLH68具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一个烟草转录因子NtbHLH68及其编码蛋白在烟碱合成代谢中的应用。

背景技术

生物碱是植物体内除萜类物质外最广泛存在的一类次生代谢物，一般呈碱性。在自然界，烟碱存在于主要的茄科植物中，其生物学功能主要是抗虫。在烟草中，主要存在4种生物碱：尼古丁、去甲尼古丁、新烟碱及假木贼碱。其中烟碱是最主要的烟草生物碱，占栽培烟草中总生物碱含量的90％～95％。因此，长期以来有关烟碱生物合成及调控的研究一直是次生代谢研究领域的焦点之一。目前对烟碱生物合成途径有了较为明晰的认识：即鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)催化鸟氨酸或由精氨酸脱羧酶(argininedecarboxylase,ADC)催化精氨酸生成腐胺，腐胺经腐胺-N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT)的催化生成N-甲基腐胺，N-甲基腐胺在N-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescine oxidase,MPO)的催化作用下生成4-甲基丁醛；经天冬氨酸途径形成的烟酸或衍生物可以形成吡啶环；吡啶环与4-甲基丁醛自然环化形成的吡咯烷环缩合成烟碱。但在烟碱生物合成的分子调控方面一直没有突破性进展，除了植物激素，烟草自身存在的调控烟碱合成的位点的角色还有待于进一步研究。

为了进一步研究烟草自身存在的调控烟碱合成的位点，提出本发明。

发明内容

本发明目的在于提供一个与烟草烟碱合成代谢相关基因NtbHLH68，从而为烟草及其他植物的烟碱含量调控分子育种提供新的策略和路径。

本申请所采取的技术方案详述如下：

本发明第一方面提供了一种烟草转录因子NtbHLH68，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供了一种第一方面所述转录因子NtbHLH66所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明第三方面提供了一种第一方面所述烟草转录因子NtbHLH68在烟草中的应用，烟草转录因子NtbHLH68与烟草烟碱合成代谢相关，将该基因沉默后，苗期烟草叶片的烟碱含量降低。

优选地，用于沉默NtbHLH68的PBWA(V)HS-NtbHLH68-RNAi载体的构建方法为：以NtbHLH68中第200-399位核苷酸作为RNAi的引导序列，将此核酸片段按照正反方向依次插入PBWA(V)HS空载体中，构建获得PBWA(V)HS-NtbHLH68-RNAi载体。

优选地，所述沉默的具体方法为：利用农杆菌介导的叶盘转化方法，将RNAi载体pBWA(V)HS-NtbHLH68-RNAi转化栽培烟草K326，通过筛选、鉴定获NtbHLH68基因沉默植株，所述NtbHLH68基因沉默植株其表型为，基因沉默的转基因植株苗期烟碱含量明显降低。

优选地，本发明提供的烟草烟碱合成代谢相关基因NtbHLH68，来源于烟草(Nicotiana tabacum L.)。

优选地，本发明提供的烟草烟碱合成代谢相关基因NtbHLH68，来源于烟草(Nicotiana tabacum L.)，编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；