[发明专利]一种提取粪便微生物RNA的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种提取粪便微生物RNA的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括裂解缓冲液、杂质去除液和酸性单相缓冲液，所述裂解缓冲液含有十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠，所述杂质去除液含有苯酚、氯仿和异戊醇，所述酸性单相缓冲液含有胍盐、缓冲盐、N‑月桂基氨酸、2‑巯基乙醇和苯酚。本发明利用CTAB与SDS协同处理，实现最大程度破坏不同类型的细菌、真菌及其他微生物的细胞壁与膜结构，高效释放核酸，通过苯酚/氯仿/异戊醇混合物和酸性单相缓冲液，去除杂质并有效分离DNA和RNA，无需使用酶处理，即可获得完整性高和质量高的粪便样本RNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提取粪便微生物RNA的试剂盒及其应用。

背景技术

随着分子生物学的快速发展，RNA正日益成为肠道粪便微生物学研究的焦点。RNA主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。RNA的提取是分子生物学的基础实验，需要高质量、高完整性的RNA用于cDNA文库构建、实时PCR、RT-PCR和Northern杂交等下游分子生物学实验。

粪便，是人或动物的大肠排遗物，含有较复杂的物质，大多由蛋白质、无机物、脂肪、腐殖质、色素、未消化的食物纤维、脱了水的消化液残余、以及从肠道脱落的细胞和细菌组成。目前从动物粪便中提取微生物RNA的研究较少，因为粪便中含有较复杂的物质，传统方法提取时间过长，往往导致提取的粪便微生物RNA降解。因此，研究一种提取高质量粪便微生物RNA提取方法具有重要意义。

CN104450685A公开了一种快速提取动物粪便微生物RNA的试剂盒及提取方法，该试剂盒主要利用硅胶模吸附柱吸附粪便微生物RNA，再采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去蛋白等杂质所述试剂盒由吸附柱及以下工作液组成：工作液A：由终浓度0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0.175-0.2mol/L氢氧化钠组成，pH＝7-8；工作液B：由终浓度10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和终浓度1-10mmol/L乙二胺四乙酸组成，pH＝5.0-8.0；工作液C：质量浓度为1-2％溶菌酶；工作液D：10-20mg/mL蛋白酶K；工作液E：质量浓度10-20％的十二烷基硫酸钠；工作液F：体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液；工作液G：体积比为氯仿：异戊醇＝24:1的混合液；工作液H：体积浓度70-80％无水乙醇；工作液I：由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度10-30mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐组成，pH＝6.0-7.0，使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇体积浓度为30-40％；工作液J：由终浓度20-50mmol/LNaCl和终浓度2-5mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐组成，pH＝7.0-8.0，调完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇浓度为80-90％。可见，其需要多种试剂及酶等成本高且操作复杂。

综上所述，目前亟需开发低成本、操作简单且能够提取高质量粪便微生物RNA的方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提取粪便微生物RNA的试剂盒及其应用，本发明设计应用于提取粪便微生物RNA的试剂并开发提取方法，操作简单、成本低且RNA提取质量高。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种提取粪便微生物RNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解缓冲液、杂质去除液和酸性单相缓冲液，所述裂解缓冲液含有十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠，所述杂质去除液含有苯酚、氯仿和异戊醇，所述酸性单相缓冲液含有胍盐、缓冲盐、N-月桂基氨酸、2-巯基乙醇和苯酚。