[发明专利]一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法；包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液；其中，所述DNA结合液由20%PEGsubgt;6000/subgt;、2.5 M NaCl、1%MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。与现有方法相比，本发明中所使用的的试剂、耗材和设备均为国产，且试剂为分析纯，价格低廉，经成本测算，每1 mg质粒的提取可以将成本控制在40~50元，且内毒素低于1 EU/mL，低于业内要求的无内毒素标准，实验过程中使用的耗材可经碱法回收，实际上可将成本进一步降低，符合我国节能减排的环保要求。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法。

背景技术

 质粒（Plasmid）广泛存在于生物界，是常见于原核细菌和真菌细胞中能独立于寄主染色体自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1～300 kb。将一个外源目的基因导入细胞，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具被称为载体（vector）。基因工程上所用述的载体特指一类能独立于细胞核DNA而自我复制的核酸分子，通过限制性核酸内切酶和核酸连接酶将目的基因剪辑至具有完整表达元件的启动子后，能够在宿主细胞中将目的基因进行转录和翻译。通过电转、PEI、磷酸钙等方法将载体转入真核细胞，与转入细菌表达系统相比，真核表达系统所表达出的蛋白更接近蛋白天然的空间结构。

 在产品研发阶段，纳克级质粒即可满足研发需求，虽然质粒的需求量低，但是如果不能保证质粒的纯度，仍会给研发造成较大的困扰。而对于抗体等生物大分子的大量生产，则需要mg至g级的无内毒素质粒。现有无内毒素或低内毒素质粒提取试剂盒或是使用成本较高，或是内毒素仍不能满足真核表达系统转染需求。真核表达系统所需要的质粒除纯度外，对质粒的超螺旋比例也有较高的要求，一般大于90 %的超螺旋比例才会有较好的转染结果，而超螺旋比例较低则会导致转染效率低下。

综上所述，需要开发一种低毒、简便、廉价的适用于真核表达系统的细菌质粒DNA提取方法。

发明内容

本发明的目的是：提供一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法，用于克服上述技术问题中的至少一种。

为实现上述目的，本发明中采用的技术方案如下：

一种低内毒素质粒提取试剂盒，包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液。

 进一步的，所述DNA结合液由20 % PEG6000、2.5 M NaCl、1 % MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。

 进一步的，所述洗涤液A由MOPS、RNase A溶解于PBS中形成。

进一步的，所述裂解液由NaOH、SDS十二烷基硫酸钠溶解于水中制得；

所述中和沉淀液的配制方法为：1 L中和沉淀液中，乙酸钾300.0 g，冰乙酸250.0g其余为水；

所述孵育液的配制方法为：1L孵育液中，包括10 g Triton X-114，10.0 g MOPS，43.83 g NaCl，150.0 g 异丙醇，其余为水。

 进一步的，所述洗杂液的配制方法为：20 mg 多粘菌素B（PMXB）、1.0 g PEG6000，7.30 g NaCl，1 g MOPS，使用超纯水定容至100 mL；

所述洗涤液B的的配制方法为：取800 mL无水乙醇，使用二次去离子水定容至1 L；

所述质粒溶解液的配制方法为：吸取1 M Tris-HCl（pH 7.4）1 mL和0.5 mM EDTA（pH 7.4）0.2 mL至100 mL容量瓶中，使用无菌水定容至100 mL。