[发明专利]一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法、由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3binding、ANK repeats、PCGF1‑interacting PUFD结构域编码序列(BCOR‑MAP)及PLSCR1基因，获得一种新型NSCs，命名为2K‑iNSCs。与传统方法相比，2K‑iNSCs诱导和维持不依赖添加小分子化合物或蛋白因子的NSCs培养基，仅在iPSCs培养基中即可持续传代并维持其神经干性。本发明还提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR‑MAP、PLSCR1基因的sgRNA、质粒及其应用。

技术领域

本发明涉及一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法。

背景技术

NSCs(Neural Stem Cells,神经干细胞)具有自我复制及分化为多种神经元和神经胶质细胞的能力，因而在体外疾病模型研究，药物筛选，再生医学领域都有巨大的应用价值。目前NSCs的获得方式主要有三种：从原代组织中分离获得，从体细胞转分化获得，从多能干细胞诱导分化获得。从人多能干细胞诱导获得尤其是从人iPSCs诱导分化获得NSCs具有细胞来源不受限制，并可进行自体移植等优点。以往的神经分化会经历多能干细胞(Pluripotent Stem Cell,PSC)的聚集或拟胚体的形成，而这个过程易导致不同批次实验之间的差异(Tao and Zhang,2016)。传统的解决方案是通过加入SB431542和Noggin来抑制SMAD依赖的TGFβ(Transforming growth factor beta)和BMP信号通路，进而阻止额外的胚体和中胚层组织的分化，这种方法的诱导效率可达到80％左右(Chambers et al.,2009)。将iPSCs诱导成NSCs普遍的方法是加入小分子化合物的NSC诱导培养基进行诱导，而这种方法不能完全将iPSCs转化为NSCs，NSCs细胞异质性大，有成瘤风险等缺点。

目前，由人iPSCs诱导分化获得的NSCs在传代培养中需要通过特定的培养基维持NSCs的特性。不同于传统的NSCs诱导和维持方法，我们通过敲除iPSCs的PLSCR1基因以及编码BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1-interacting PUFD结构域序列(BCOR-MAP)获得的NSCs，仅需要使用iPSCs培养基即可维持其NSCs特性不变，具有纯度高，细胞异质性低、增殖能力强、可在体外长期培养以及不易发生自发分化等优点。

从人体组织中分离获得NSCs的方法具有来源受限，分离出的NSCs异质性大，数量及扩增能力有限等缺点。从体细胞转分化获得NSCs的方法，由于体细胞增殖能力比较弱，增殖代数有限，细胞数量会受到限制，转分化效率比较低。利用商业化的添加小分子化合物或蛋白因子的培养基获得的NSCs具有异质性较高，有自发分化及成瘤风险等缺点。此外，诱导和维持NSCs的培养基需要添加不同组分的小分子化合物或蛋白因子，限制了NSCs的基础研究及临床应用。因此，传统方法中，培养基的成分对于iPSCs诱导为NSCs的效率及其神经干性维持具有关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，本发明还提供了由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1-interacting PUFD结构域(BCOR-MAP)编码序列及PLSCR1基因，获得一种新型NSCs，命名为2K-iNSCs。与传统方法相比，2K-iNSCs诱导和维持不依赖添加小分子化合物或蛋白因子的NSCs培养基，仅在iPSCs培养基中即可持续传代并维持其神经干性。本发明还提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR-MAP、PLSCR1基因的sgRNA、质粒及其应用。

为实现上述目的，所采取的技术方案：