[发明专利]一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法

说明书

本发明公开了一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，包括：体外共培养、点击化学反应、流式细胞分选。本发明基于点击化学技术，将炔基修饰的天然产物与粪便菌群共培养，通过铜催化的叠氮‑炔基环加成反应，将叠氮化的荧光染料标记在所有能摄取利用天然产物或天然产物代谢物的细菌上，再利用流式细胞分选技术分离出这些细菌。本发明与单一菌种培养研究代谢与利用的方法相比，成本低、周期短，为广泛、深入研究肠道菌群和天然产物的互作提供了新的思路。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法；具体的说，涉及一种基于点击化学技术表征与分离能特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的方法。

背景技术

人体肠道中生存着约10万亿个细菌，包含数百或数千个细菌分类群体，它们对人体的健康发挥至关重要的作用。肠道菌群通过初级或次级代谢途径产生许多小分子，其中一些保留在肠道中，还有一些会进入循环被宿主化学修饰或通过尿液排出。不同的肠道细菌会特异性摄取不同的营养成分，如拟杆菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属主要摄取并代谢膳食鞘氨醇，拟杆菌属，双歧杆菌属、肠球菌属和副拟杆菌属是饮食来源胆固醇的主要互作微生物。

天然产物，包括氨基酸、多糖、维生素、脂肪、生物碱、黄酮、萜类、酚类、甾体化合物等，已被证明可以通过调节肠道菌群的平衡来预防和治疗多种疾病。天然产物不仅作用于肠道菌群，通过抑制或促进部分菌属的生长，改变肠道菌群结构，进而发挥其效应，也会被肠道菌群代谢转化，包括水解、脱糖基、酶解等反应。

点击化学又称“链接化学”，是通过小单元的拼接，快速、可靠地完成各种分子的化学合成，代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应。点击化学反应快速、操作简单，且反应条件温和、副产物对细胞无毒害。除了化学合成，点击化学技术已被应用于药物靶点鉴定、新药研发、癌症追踪、分子识别与传感等多个领域。

研究肠道微生物对天然产物的摄取与代谢所面临的一个巨大挑战是肠道微生物的种类繁多，使用传统的单一菌种培养的方法去筛选成千上万的分离菌种是否能代谢某种化合物成本高、周期长。且有些菌种难以分离培养，因此，传统的方法不能囊括所有的肠道微生物。

同时，单一培养的菌种和混合培养的细菌群体之间存在基因表达和生化转化过程的差异。在单一培养的细菌中不被代谢的化合物，有可能在混合培养中被细菌摄取利用，因此，传统单一菌种培养的方法并不适用于模拟肠道菌群对化合物摄取利用的高通量筛选。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，为研究天然产物和肠道微生物互作提供新思路。

本发明是一种基于点击化学技术快速表征与分离能特异性摄取或代谢某种天然产物的细菌方法。包括了体外共培养、点击化学反应和流式细胞分选三个步骤。与单一菌种培养研究代谢与利用的方法相比，本发明的方法成本低、周期短。

本发明基于点击化学中具有代表性的炔烃-叠氮环加成反应，对特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群进行表征与分离。天然产物结构末端使用炔基修饰，荧光染料AlexaFluor 647末端使用叠氮修饰。细菌摄取炔基修饰的天然产物或仍然保留炔基的天然产物代谢物后，与后续加入的AF647叠氮化物进行点击化学反应，从而被标记上红色荧光。使用流式细胞分选仪分离出AF647⁺的细菌群体，即获得能特异性摄取天然产物的菌群。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，包括以下步骤：

(1)体外共培养：将菌群与天然产物在培养基中共培养；

(2)点击化学反应：将经步骤(1)培养的细菌进行铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应；