[发明专利]用于制备普瑞巴林中间体的海因酶

说明书

本发明公开了一种海因酶突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5，其能够高效催化3‑异丁基戊二酰亚胺水解为(R)‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸，为普瑞巴林手性中间体的生物催化法生产提供了一种新途径。

技术领域

本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种海因酶突变体及其在制备普瑞巴林手性中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的用途。

背景技术

普瑞巴林(Pregabalin)化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，于2004年12月获得FDA批准上市，主要用于带状疱疹后神经痛、纤维肌痛、糖尿病性外周神经痛和4岁及以上患者癫痫部分发作等的治疗。此外，欧洲EMA于2006年3月还批准普瑞巴林用于治疗广泛性焦虑(GAD)，该产品已在全球130多个国家和地区上市，是全球最畅销的镇痛药。其中S-普瑞巴林是γ-氨基丁酸的结构类似物，作为镇痛、抗惊厥和抗焦虑药物广泛应用于临床治疗。S-普瑞巴林药物在口服后迅速被人体吸收并主动转运到大脑中，因此与其他γ-氨基丁酸类药物相比，S-普瑞巴林的疗效更佳。

据全球畅销药数据统计，辉瑞普瑞巴林销售额从2005年的2.91亿美元增长到2018年的49.70亿美元。辉瑞普瑞巴林专利于2018年12月到期后，美国FDA在2019年7月同时批准了梯瓦制药、雷迪博士实验室等9家制药企业的普瑞巴林仿制药上市，致使辉瑞普瑞巴林在美国市场上收到仿制药的冲击，导致其全球销售额出现大幅度下滑，2019年下降至33.21亿美元。随着2019年12月，石药集团普瑞巴林胶囊的简约新药申请获得美国FDA批准，标志着普瑞巴林将面对越来越多质优价廉国产仿制药的竞争，因此生产工艺和成本降低成为了各家竞争的焦点。

目前S-普瑞巴林的工业化规模生产工艺是利用2-氰基乙酰胺和异戊醛合成环亚胺，然后碱水解获得混消旋的R/S-单酰胺，进一步在氯仿溶液中使用R-(+)-1-苯乙胺进行化学拆分获得手性中间体R-单酰胺，最后经Hofmann重排反应合成S-普瑞巴林。美国专利US2014/0243412A1提供了一种普瑞巴林关键中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法，其反应式如下：

化学拆分步骤需要使用大量的有机溶剂，污染重、周期长、收率低，因此开发普瑞巴林中间体的绿色合成工艺成为产业需求。

针对中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸化学工艺路线中污染严重、效率较低的R-单酰胺化学拆分步骤，开发一步酶法手性合成R-单酰胺的技术工艺成为众多生物合成技术领域的热点之一。专利文献CN113755539A公开了一种荧光假单胞菌来源的两种二氢嘧啶氨基水解酶(Dihydropyrimidinase，NCBI登录号：WP_011030900.1和WP_011334810.1)能够催化3-异丁基戊二酰亚胺反应生成ee值为99.5％以上的高光学纯度(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。但我们经实验验证发现这两种酶的酶催化活力有限，限制了工业化应用。

发明内容

受专利文献CN113755539A的启发，考虑到3-异丁基戊二酰亚胺是环酰亚胺类化合物，而海因酶(乙内酰脲酶水解酶，乙内酰脲酶，hydantoinase，简称Dhase)能够水解具有类似结构化学基团的化合物，具有催化环亚胺合成R-单酰胺的活性，发明人推测特定的海因酶有可能具有水解3-异丁基戊二酰亚胺生成(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的潜力，于是尝试对已报道的多种微生物来源的海因酶通过实验进行筛选比较，发现一株皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)来源的海因酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，NCBI登录号：AAL37185.1)能够高度立体选择性地水解3-异丁基戊二酰亚胺并得到高光学纯度的目标产物(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，而且其比活力高于CN113755539A公开的二氢嘧啶氨基水解酶(NCBI:WP_011030900.1和WP_011334810.1)。为了进一步提高该海因酶的催化活性，我们还通过突变技术筛选到酶活力明显提高的两个突变体。具体地，本发明的技术方案如下。