[发明专利]一种提高单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用

权利要求书

1.一种提高单增李斯特菌膜囊泡产量的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)敲除单增李斯特菌野生株LM的dal、dat基因，获得菌株LMΔdaldat，并制备LMΔdaldat感受态细胞；

(2)将打靶质粒pCW633电转入LMΔdaldat感受态细胞中，得到菌株LMΔdaldat::pCW633；

(3)培养LMΔdaldat::pCW633，离心取上清，提取纯化得到单增李斯特菌膜囊泡LMMVs。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法如下：

(1-1)单增李斯特菌野生株LM制备得到感受态LM，将打靶质粒pCW619-LMdal电转入LM感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.1所示的引物pCW619-Lmdal-F和SEQ IDNO.2所示的引物pCW619-R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.3所示的引物LMdal-F、SEQ ID NO.4所示的引物LMdal-R、SEQ ID NO.5所示的引物HomoLMdal-F、SEQ IDNO.6所示的引物HomoLMdal-R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔdal，制备LMΔdal感受态细胞；

(1-2)将打靶质粒pCW619-LMdat电转入LMΔdal感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.7所示的引物pCW619-Lmdat-F、SEQ ID NO.2所示的引物pCW619-R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.8所示的引物LMdat-F、SEQ ID NO.9所示的引物LMdat-R、SEQ ID NO.10所示的引物HomoLMdat-F、SEQ ID NO.11所示的引物HomoLMdat-R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔdaldat，制备LMΔdaldat感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，菌株LMΔdaldat::pCW633的制备方法如下：将打靶质粒pCW633电转入LMΔdaldat感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.22所示的引物asd-SX-F、SEQ ID NO.23所示的引物asd-SX-R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔdaldat::pCW633。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，打靶质粒pCW633的制备方法如下：

(2-A)培养携带pCW630质粒的大肠杆菌，提取质粒pCW630，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，利用SEQ ID NO.13所示的引物Vector633-F、SEQ ID NO.14所示的引物Vector633-R从质粒pCW630中扩增载体片段Vector633，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；利用SEQ ID NO.15所示的引物phly-LM dal-F、SEQ ID NO.16所示的引物phly-LM dal-R从质粒pCW630中扩增插入片段phly-LM dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，连接载体片段Vector633与插入片段phly-LM dal，得到连接产物；

(2-B)连接产物转化大肠杆菌DH5αΔasd感受态细胞，利用SEQ ID NO.19所示的引物pCW633-SX-F、SEQ ID NO.20所示的引物pCW633-SX-R进行菌落PCR筛选，提取质粒pCW633，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，LMΔdaldat::pCW633培养的具体方法如下：将菌株LMΔdaldat::pCW633划线接种至BHI平板，于37℃培养24小时；挑取平板上的单菌落接种至5mL BHI肉汤中，于37℃，200rpm摇育16小时；吸取250μL新鲜的菌液接种至25mL BHI肉汤中，于37℃，200rpm摇育16小时；调节菌液OD600值至1.0，取菌液按体积比1:100接种至BHI肉汤中，于37℃，200rpm摇育16小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的工艺条件为：4℃，12000g离心10分钟。