[发明专利]一种去细胞真皮水凝胶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种去细胞真皮水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤包括：

S1、制备M1表型极化的巨噬细胞条件培养基以及M2表型极化的巨噬细胞条件培养基；

S2、取动物来源的真皮层，将所述真皮层依次进行去细胞处理、第一冻干处理以及粉碎处理，制得真皮去细胞支架；

S3、将所述真皮去细胞支架溶解于含有盐酸以及胃蛋白酶的PBS溶液中，制得真皮去细胞支架溶液，并依次进行消化处理、酰化处理、透析处理以及第二冻干处理，制得光敏性去细胞真皮冻干粉；

S4、将所述M1表型极化的巨噬细胞条件培养基、所述光敏性去细胞真皮冻干粉以及光引发剂混合，制得M1型免疫因子的去细胞预凝胶；

S5、将所述M2表型极化的巨噬细胞条件培养基、所述光敏性去细胞真皮冻干粉以及光引发剂混合，制得M2型免疫因子的去细胞预凝胶；

S6、将所述M1型免疫因子的去细胞预凝胶包覆于所述M2型免疫因子的去细胞预凝胶之外，并于紫外照射下进行固化处理，即得所述去细胞真皮水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：

S11、分离小鼠的胫骨以及股骨，消毒后，采用DMEM完全培养基将胫骨以及股骨中的骨髓冲洗至离心管中；

S12、在所述离心管中加入红细胞裂解液，反复吹打后静置，静置后进行离心处理并去除上清液；

S13、在所述离心管内加入DMEM细胞培养液悬浮细胞并进行过滤处理后进行离心，去除上清液并重复本步骤一次；

S14、在所述离心管内加入刺激培养基，诱导所述骨髓细胞分化为所述巨噬细胞；调整细胞密度至1×10⁶个/mL并置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待后续处理；所述刺激培养基为含有10ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的所述DMEM完全培养基；

S15、更换所述刺激培养基继续培养4天后，再次更换所述刺激培养基；在所述刺激培养基中加入100ng/mL脂多糖或含有50ng/mL IFNγ的100ng/mL脂多糖，进行所述M1极化处理；或

在所述刺激培养基中加入10ng/mL IL-4和/或10ng/mL IL-13，进行所述M2极化处理；

S16、分别收集所述M1极化处理以及所述M2极化处理后的培养基，离心取上清，即得所述M1表型极化的巨噬细胞条件培养基以及所述M2表型极化的巨噬细胞条件培养基。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述去细胞处理包括：将所述真皮层依次进行若干次的搅拌处理；

所述搅拌处理的程序包括：

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述消化处理包括：将所述真皮去细胞支架溶液在35℃-40℃持续搅拌48h-96h后，过滤去除大颗粒并加入10×PBS溶液终止消化；所述10×PBS溶液与所述真皮去细胞支架溶液的体积比为1：(8-10)；

所述酰化处理包括：在所述消化处理完成后所述真皮去细胞支架溶液中加入碱性溶液调节pH至8-9，并加入甲基丙烯酸，35℃-40℃持续搅拌24h-72h后，加入1×PBS溶液终止酰化反应；所述1×PBS溶液与所述真皮去细胞支架溶液的体积比为(4-6)：1；

所述透析处理包括：在所述酰化处理完成后的所述真皮去细胞支架溶液中加入碱性溶液调节pH至7.35-7.45，并透析48h-96h；

所述第二冻干处理包括：将所述透析处理完成后的所述真皮去细胞支架溶液在35℃-40℃的温度下持续搅拌48h-96h，并于-85℃～-75℃冷冻0.5h-1.5h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述真皮去细胞支架溶液中，所述真皮去细胞支架的浓度为8mg/mL-12mg/mL，所述盐酸的浓度为0.005mol/L-0.015mol/L，所述胃蛋白酶的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL；所述碱性溶液的浓度为8mol/L-12mol/L；所述甲基丙烯酸与所述真皮去细胞支架的比例为0.5mL/g-1.5mL/g；所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.3mL/min-0.8mL/min。