[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、设计一种特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡CAR基因的第五个外显子区域，且靶序列唯一；

步骤2)、构建一种用于靶向敲除鸡CAR基因的CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白基因和sgRNA序列位于同一载体上，所述载体为lentiCRISPR v2；

步骤3)、将步骤2)构建的含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA的lentiCRISPR v2质粒转染到细胞中，利用CRISPR-Cas9系统编辑实现CAR基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源CAR敲除的细胞系。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中，对鸡CAR基因设计了1条sgRNA，所述sgRNA的靶位点位于CAR基因的第五个外显子，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，其特征在于，所述的特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA编码链及互补链，其序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中，靶向鸡CAR基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，之后通过BsmBI限制性内切酶酶切载体，将双链DNA置于T7启动子之下构建获得。

5.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤3)中，所述的细胞系为敲除鸡CAR基因的鸡肝癌细胞。