[发明专利]一种乌司他丁纯化方法及乌司他丁产品

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乌司他丁纯化方法，以及由该纯化方法所纯化得到的高纯度乌司他丁产品。其中，所述纯化方法包括将溶解有乌司他丁粗品的溶解液依次经过阴离子交换层析步骤、阳离子交换层析步骤和冻干步骤。由本发明所提供的乌司他丁纯化方法所纯化得到的乌司他丁产品性状稳定，为白色粉末，溶液的澄清度与颜色为澄清无色，且满足纯度≥98％，凯氏定氮法测比活＞4000IU/mg，激肽酶物质Asubgt;405nm/subgt;≤0.03。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乌司他丁纯化方法，以及由该纯化方法所纯化得到的高纯度乌司他丁产品。

背景技术

乌司他丁(UTI)，为新鲜人尿中提取的一种能抑制多种蛋白水解酶活力的糖蛋白，属蛋白酶抑制剂。临床上可用于治疗急性胰腺炎，慢性复发性胰腺炎，亦可用于急性循环衰竭的抢救辅助用药。乌司他丁含有143个氨基酸，其氨基酸序列中的第10位丝氨酸(O-糖基化位点)和第45位天冬酰胺(N-糖基化位点)上有糖链，长肽链中含有6对二硫键。化学结构式如图1所示。

人尿中含有三百多种蛋白质，有尿激酶、乌司他丁和人尿激肽原酶等。对于从尿液中获得高纯度的乌司他丁，一般包括提取得到粗品再经纯化得到高纯度的乌司他丁。其中粗品中含有人尿激肽原酶等多种杂质蛋白以及大量色素杂质。药典标准规定溶液的澄清度和颜色应澄清无色；如显色，与黄色1号标准比色液比较，不得更深，激肽酶物质≤0.03，有关物质总杂≤2.0％、比活≥3500IU/mg等。

中国发明专利CN100425286C公开了一种乌司他丁的纯化的方法，对粗品先用乙醇沉淀纯化再经阴离子交换柱、金属螯合柱、疏水柱、阴离子交换柱子、凝胶柱子得到高纯度乌司他丁，可见，步骤多，工艺繁琐，收率低，工艺周期长。

中国发明专利CN105837685A公开了一种采用阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法，在上柱前需要对粗品缓冲溶液采用海藻酸钠处理得沉淀物，而若不采用该工序处理，即使经两次阴离子交换树脂纯化纯度也较低，仅为90％，且收率仅为70％。

中国发明专利CN107936114B、CN105753976A均采用了阳离子交换色谱，在pH大于4的条件下吸附杂质进行柱层析纯化。

乌司他丁粗品采用水溶解后用超滤膜浓缩后采用乙醇沉淀后再经阳离子柱层析后的乌司他丁精制品，可以得到高比活指标，但存在激肽酶原物质超标(＞0.1)、纯度超标(有关物质≥5％)的问题。

同时，现有乌司他丁产品性状不稳定，容易呈微黄色，如中国发明专利CN107827977A的实施例4所制备得到的淡黄色固体粉末的乌司他丁纯品。按照中国药典乌司他丁溶液项下的颜色检验对淡黄色乌司他丁纯品检测，结果普遍为澄清无色，即符合规定的要求。这种现象出现的原因在于乌司他丁纯化过程中一类影响产品颜色的杂质难以被完全去除而又难以在纯度检测过程中被检出。因此该类杂质在乌司他丁的检测过程中容易被忽略，导致产品颜色的改变。现有证据已经充分证明该类杂质的存在影响乌司他丁的稳定性。因此，亟需一种可稳定去除该类影响颜色杂质的乌司他丁纯化方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种工艺步骤简单、纯化收率高的乌司他丁纯化方法，以及由该纯化方法所纯化得到的高纯度，且白色性状稳定的乌司他丁产品。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种乌司他丁纯化方法，包括将溶解有乌司他丁粗品的溶解液依次经过阴离子交换层析步骤、阳离子交换层析步骤和冻干步骤。

其中，所述阴离子交换层析步骤所使用的填料选自Q Sepharose 4FF和DEAESepharose 4FF中的一种；

所述阳离子交换层析步骤所使用的填料选自SP Sepharose 4FF和CM Sepharose4FF中的一种。