[发明专利]一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用，向人羊膜上皮干细胞中加入含有抗坏血酸或其衍生物、碱性成纤维细胞生长因子以及视黄酸的细胞培养基，诱导产生的细胞高表达Keratocan、Lumican和ALDH1A1等角膜基质细胞特异性标记物。诱导产生的细胞免疫原性低，可以良好地整合到天然的角膜基质结构中，表明其具有移植潜力。将诱导产生的细胞结合GelMA水凝胶，移植到角膜损伤部位。通过荧光素钠染色以及裂隙灯观察显示其具有促进角膜损伤愈合，抑制纤维化形成的作用。本发明开发的无血清诱导体系能够用于人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞的分化以及治疗角膜损伤相关的疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从人羊膜上皮干细胞诱导分化出人角膜基质细胞样细胞的方法及其在治疗角膜损伤性疾病中的应用

背景技术

一直以来，临床上角膜移植供体短缺的问题都亟待解决。近年来，组织工程化角膜作为天然角膜的替代品，被认为是值得发展的新策略。然而，角膜生物工程受到种子细胞(如角膜基质细胞)不足的限制。考虑到人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞具有分化成三胚层细胞的多能性，多个研究团队尝试将这两类细胞或其分化产物作为种子细胞。值得注意的是，关于这两类干细胞的致瘤性以及伦理等问题尚未得到很好地解决，限制了进一步的临床转化。鉴于胚胎干细胞和诱导多能干细胞应用的局限性，体细胞来源的干细胞又逐渐成为研究热点，然而对于这类细胞而言，如何大规模获得以及伦理问题仍有待解决。基于以上现状，开发一种新型干细胞用于角膜细胞的分化显得尤为必要。

胎盘作为一种通常被丢弃的器官，较少涉及伦理问题，是得到大量围产期干细胞的理想来源。此外，胎盘属于新生儿附属组织，其环境和年龄相关性的基因损伤较少，是再生医学的理想选择。胎盘的最内层结构是羊膜，羊膜在眼科中作为生物敷料被广泛应用，大量临床试验证实了其具有促进角膜创面愈合的能力。值得一提的是，从羊膜中分离出的人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells,hAESCs)具有多向分化潜能、免疫调节能力、低免疫原性、无致瘤性、来源广泛等显著优势。结合hAESCs的上述特性，利用其诱导分化出种子细胞用于角膜组织工程将充满希望和前景。大多数情况下，角膜机械损伤只涉及到角膜上皮层和基质层。一方面，角膜上皮细胞相较于基质细胞，具有更强的自我更新和伤口愈合能力，另一方面，从角膜解剖结构来看，基质层占整体厚度的90％以上，因此构建组织工程化角膜对于角膜基质细胞的需求更大。目前将hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞的方法还未被报道。

基于hAESCs的优势属性，本发明开发了一套无动物血清，且化学成分明确的分化体系，首次尝试将胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞，实现了生物废弃物的再利用。同时该分化体系克服了常规分化体系中添加动物血清或使用成分不明培养基等违反临床使用指南的操作，为临床转化应用奠定了基础。最后，本发明在角膜损伤模型中验证了其对于角膜损伤修复的促进作用。

发明内容

针对当前组织工程化角膜缺乏种子细胞的问题，本发明提供了一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用，本发明地将废弃胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞。本发明开发的hAESCs分化体系无动物血清、化学成分明确，并且在角膜损伤动物模型中验证了其应用潜力。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离人羊膜上皮干细胞，在合适条件下贴壁培养24-48小时；

(2)将细胞培养液换为诱导组合物继续培养，诱导人羊膜上皮干细胞分化为人角膜基质细胞；

其中，所述的诱导组合物为含有0.01-5mM抗坏血酸或抗坏血酸的衍生物、1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及0.05-20uM视黄酸的细胞培养基。