[发明专利]芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法

说明书

本发明涉及植物基因功能技术领域，旨在提供一种芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法。包括：根据芍药芽休眠全长转录组中的基因注释及保守序列区域设计扩增引物，将目的基因保守序列片段构建至含pTRV载体的根癌农杆菌中；以经处理的芍药一年生实生苗的根茎作为侵染材料，置于含有pTRV1、pTRV2、pTRV2‑目的基因片段的根癌农杆菌菌液中进行侵染处理；根茎上盆并移入培养室进行培养，观察生长过程中与对照组的表型与表达量差异，确认同源沉默体系构建成功。本发明首次完成对芍药类植物地下根茎系统的小型化处理和批量化菌液侵染，建立基于病毒介导的芍药类植物芽休眠基因的同源功能沉默系统，实现验证芽休眠乃至萌发、生长相关基因的功能的目的。

技术领域

本发明涉及植物基因功能研究领域，具体涉及一种芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法。

背景技术

芍药科仅有芍药属，主要由芍药组(Sect.Paeonia)和牡丹组(Sect.Moutan)构成，前者均为草本植物，后者均为木本植物。其中，芍药组包含芍药(Paeonia lactiflora)、草芍药(P.obovata)、美丽芍药(P.mairei)、窄叶芍药(P.anomala)等30多种球宿根花卉，具有重要的观赏、药用、油用、茶用等价值，其中芍药为中国传统名花和世界名花。芍药类植物大多性喜冷凉干燥，其在中国主产于华北、西北和东北等地区。秋季气温降低后，芍药类植物进入休眠期，地上茎叶开始枯萎，以着生于根茎(rhizome)等地下延存器官的休眠芽(dormant bud)度过寒冬，芽历经由内生因素导致的生理休眠(endodormancy)和外在环境诱发的生态休眠(ecodormancy)阶段，翌年春季破土萌发，抽枝展叶，开花结果，入秋后整株再次枯萎和休眠。

中国江南、华南和中部大部分地区的冬季温度较高，冷积累无法满足，易引发芽生理休眠解除障碍，严重影响翌年春季的萌芽和生长，最终导致开花结果受阻，且根茎严重退化；气候变暖也在加剧该问题的严重性，这是培育我国南方芍药类植物品种群的主要限制因子。

研究芍药类植物芽的生理休眠解除机理，尤其是探索芽生理休眠相关基因的功能，并以此为基础，借助分子育种等手段选育出生理休眠期短的低需冷量种质，是培育南方芍药类植物品种群的关键工作。随着全球气候异常，芽休眠相关的基因研究也成为国际植物科学研究中的热门领域。但是，芍药类植物的遗传转化体系构建非常困难，通过同源转基因后的过表达技术来验证其各类基因的功能，至今尚未实现。

近些年来，以病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)为主要手段的瞬时同源验证，开始逐步被应用到包含牡丹类的芍药科植物中来。VIGS是一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化来验证基因功能。VIGS技术具有快速、高效、通量高等优点，该技术被广泛应用于植物生长发育、抗病虫、代谢调控等方面功能基因研究中，也被初步应用在芍药科植物的花色形成、花茎强度和植株抗性相关的基因功能验证上。但如果针对芍药类植物的芽休眠相关基因开展功能验证，需要针对地下根茎开展根癌农杆菌菌液浸染，完成VIGS整套操作。但是，芍药类植物成年植株的地下根茎系统非常庞大，且为肉质根茎，极易溃烂，难以完成菌液浸染操作。

因此，有必要建立一套简捷、高效、能够在合理的空间内操作完成的VIGS基因沉默体系，可以显著促进芍药类植物休眠特性的分子机理研究，对芍药等中国传统名花的南方种质创新具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服当前技术中存在的缺陷，提供一种芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法，其特征在于，该方法基于芍药地下芽休眠全长转录组的唯一性，通过将芍药类草本植物庞大的地下根茎系统在菌液侵染时予以小型化操作，从而实现芽休眠调控基因的功能沉默研究；具体包括下述步骤：