[发明专利]芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法

权利要求书

1.一种芍药类植物芽休眠基因的同源沉默体系的构建方法，其特征在于，该方法基于芍药地下芽休眠全长转录组的唯一性，通过将芍药类草本植物庞大的地下根茎系统在菌液侵染时予以小型化操作，从而实现芽休眠调控基因的功能沉默研究；具体包括下述步骤：

(1)根据芍药芽休眠全长转录组中的基因注释及保守序列区域，设计扩增引物；利用扩增引物克隆目的基因保守序列片段，并将其构建至含pTRV载体的根癌农杆菌中；

所述芍药芽休眠全长转录组是公布于NCBI网站的全球共享数据，登录号为PRJNA487256；其来源是单分子实时和二代测序技术进行结合的联合测序所获得的芍药芽休眠期间的三代全长转录组和不同芽休眠期的二代转录组数据，具体内容包括序列全长、功能注释和表达量结果；

(2)在9月上旬至10月中旬之间，选择芍药一年生实生苗的根茎，去除地上残留茎叶并保留1-3个地下休眠芽；上盆后转入4℃的冷库，进行3-5周的无光低温处理；

(3)取出低温处理后的根茎，清洗后去除所有须根；在根茎顶端休眠芽的芽鳞基部扎若干个小孔后，作为备用的侵染材料；

(4)配制含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-目的基因片段的根癌农杆菌菌液，将侵染材料置菌液中进行侵染处理；将根茎上盆并移入培养室进行培养，观察生长过程中与对照组的表型与表达量差异，确认同源沉默体系构建成功。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，选择芍药科芍药属内所有能正常结种、且种子能够萌发并于翌年发育成根茎的草本类芍药种质。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述一年生实生苗根茎是指：在前一年播种，经冬季休眠和翌年春季萌发后，在夏秋季形成的顶部含有休眠芽的肉质指状的根茎。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，按下述标准选择根茎：根长在8-12cm、根粗在0.6-1.2cm；只有一条明显的主根，无侧根分枝或少分枝，须根丰富；根部无病虫害和发霉溃烂，根颈上部有1-3个休眠芽。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，9月上旬至10月中旬是将芍药进行低温处理的最佳时期；该期间芍药地上茎叶已经枯萎，结束了上一个年周期；且该期间日均温相对较高，能确保在冷积温为零的前提下开展低温处理，保证根茎所获得的冷积温均来自于人工定量低温处理。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，如拟侵染处理的目标基因的功能预估为抑制休眠解除，则4℃低温处理时间控制在3-4周；如拟侵染处理的目标基因的功能预估为促进休眠解除，则4℃低温处理时间控制在4-5周。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，侵染前去除小根茎上的所有须根，便于后续统计长根情况；注射器针头扎孔部位深0.5cm，为小根茎顶端芽鳞基部与小根茎肉质主体部分的衔接处；不能直接对芽进行扎孔，防止溃烂。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，侵染处理的具体操作包括：

(1)使用1L烧杯盛装根癌农杆菌GV3101的菌液，将多个根茎以头部向上根部向下的方式纵向排列于烧杯中，根茎最高处应低于烧杯上缘5cm以下；需侵染的部位包括根茎、顶端休眠芽以及扎孔部位，均应淹没菌液中；

(2)将烧杯移至抽真空装置中，启动真空泵抽真空并保持至少30分钟，然后放气20分钟。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，对根茎进行培养时，分为两个阶段：

(1)先在湿度60％、温度20-21℃的条件下，暗培养3天；

(2)调整为暗培养与光照培养交替，控制湿度60％；光照培养时，温度25℃、光照4000lxs、时长14-16h；暗培养时，温度18℃、时长10-8h。