[发明专利]一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法

说明书

本发明属于生命科学领域，公开了一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法。该分离培养方法选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，包括：(1)取SD乳鼠；(2)无菌取出SD乳鼠双肾放在PBS缓冲液中并去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等；(3)将肾组织剪碎，并采用PBS冲洗后进行离心分离；(4)先后采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ次多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；(5)将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基接种于培养皿后，静置培养，即得；(6)采用CK18免疫荧光鉴定。本发明分离培养方法条件温，对细胞伤害小，所提取的肾小管上皮细胞不仅数量多，纯度高、活力好，而且增殖速度快，可传代次数高。

技术领域

本发明属于生命科学领域，涉及一种细胞的分离培养方法，尤其涉及一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法。

背景技术

肾脏是药物重要的代谢消除器官，其中肾小管是葡萄糖和水重吸收以及大部分药物排泄的主要部位，作为肾小管主要组成成分的近端肾小管上皮细胞便自然而然地成为肾脏功能最主要的执行者，同时也是驱动急性到慢性肾脏疾病进展的首要靶器官，在药源性肾损伤和药理研究中具有极其重要的地位。

在当前药物研发的流程中，动物实验仍然是临床前肾毒性评估的金标准，但是由于细胞功能和进程的研究在动物实验中不具备高操作性，因此细胞体外培养便成为众多科研工作者的首选方案。尽管细胞系因其容易培养且产量可观的优势已在科学发展中起了重要作用，然而仅仅由细胞系得来的数据却越来越难有说服力。其中主要的原因是它们会不断发生突变，连续传代导致它们的基因型和表型发生变化，且存在着鉴定错误和交叉污染的问题。

相比之下，原代细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性更大，且保持了细胞在体内的许多重要标志和功能作用，更接近于机体内细胞的新陈代谢过程，因此逐日成为科研学者青睐的研究工具。但是原代细胞是出了名的难培养，容易出现提取污染、酶的作用浓度及时间无法把控、细胞纯度不够、生长缓慢和传代有限等问题。

结合当前研究现状，建立理想的高仿生的体外肾小管模型，将有助于搭建肾脏功能研究、药物吸收排泄以及药物肾毒性等研究“快车”，以加快药物筛选进程、提高大规模开发生物化合物效率和临床试验成功率。

为此本发明提供了一种SD乳鼠肾小管上皮的分离培养及鉴定方法，以期对肾原代细胞培养及鉴定提供可靠的理论支撑和实践依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法，主要用于解决肾原代提取易污染、消化酶的不合理使用以及细胞纯度低、生长缓慢等问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，具体包括如下步骤：

(1)禁乳消毒：取禁乳4～6h的SD乳鼠，洗净擦干消毒备用；

(2)取材：无菌打开SD乳鼠腹腔，取出双肾放在PBS缓冲液中用组织剪和镊子去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等；

(3)机械分离肾脏组织：将所有的肾脏用无菌预冷的PBS洗净后置于倾斜皿底，用剪刀将肾组织剪碎后转移至离心管，加入适量PBS用移液枪反复吹打后进行离心分离，弃上清，直至上清澄清且无明显血色；

(4)酶分离法：先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质后，再加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；

(5)原代细胞培养：将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿后，静置孵箱中培养，即得SD乳鼠肾小管上皮细胞。

优选地，步骤(1)中所述禁乳4～6h，洗净擦干消毒的方法为：