[发明专利]一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法

权利要求书

1.一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，具体包括如下步骤：

(1)禁乳消毒：取禁乳4～6h的SD乳鼠，洗净擦干消毒备用；

(2)取材：无菌打开SD乳鼠腹腔，将取出的双肾放在PBS缓冲液中，用组织剪和镊子去除肾脏多余的脂肪、肾外包膜及肾蒂等；

(3)机械分离肾脏组织：将所有的肾脏用无菌预冷的PBS洗净后置于倾斜皿底，用剪刀将肾组织剪碎后转移至离心管，加入适量PBS用移液枪反复吹打后进行离心分离，弃上清，直至上清澄清且无明显血色；

(4)酶分离法：先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质后，再加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；

(5)原代细胞培养：将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿后，静置孵箱中培养，即得SD乳鼠肾小管上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述禁乳4～6h，洗净擦干消毒的方法为：

取出生3～5天断乳4～6h的SD乳鼠，先用清水洗去身上脏物，再用75％的酒精棉球依次擦拭每一只新生SD乳鼠体表；

采用颈椎脱位法使SD乳鼠迅速死亡，将整只动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中消毒5min，持镊子依次夹取每只SD乳鼠放在大平皿中携入紫外消杀后的超净工作台，备用。

3.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述取材的具体操作方法为：

左手捏紧SD乳鼠颈背部皮肤充分暴露腹部，右手持镊子夹取酒精棉球再次消毒SD乳鼠腹部；

将SD乳鼠腹部朝上平置于操作台面，左手持镊子上提SD乳鼠腹部皮肤与肌肉，右手持灭过菌的眼科剪沿后腿根部连线横向剪开，再向头部方向纵向剪出“倒T”字形路径，依次无菌取出双肾并置于无菌预冷的PBS缓冲液中；

持镊子夹取酒精棉球擦拭操作台面，将眼科剪和镊子置于酒精灯上消毒，继续重复上述步骤直至完成所有双侧肾脏取材，并用组织剪和镊子逐个去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等。

4.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心分离的方法为：

将剪碎后的组织碎块转移至15ml离心管中，加入适量PBS用移液枪反复吹打直至组织块发白，离心800～1200rpm，5～8min弃去上清，反复操作直至上清澄清且无明显血色为止。

5.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质的操作方法为：

先向肾脏组织沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后离心弃上清，此时肉眼可看到肾脏组织块已经出现明显分解，显微镜下可观察到部分肾小管节段已暴露出来；

继续向沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后显微镜下可以明显看到很多“网织状”的长条肾小管节段，继续离心弃上清。

6.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述胰蛋白酶采用如下方法配置：

称取胰蛋白酶粉0.2g溶于100mlPBS中，再加100ul5mol的EDTA和5ul酚红，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得。