[发明专利]一种高产纳豆激酶的流加补料发酵方法

说明书

本发明属于发酵工程领域，特别涉及一种高产纳豆激酶的流加补料发酵方法。包括以下步骤：(1)活化地衣芽孢杆菌，制备成成熟的种子液；(2)将种子液按1‑5％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，初始搅拌转速200r/min，初始通风比0.5‑1V/V·m，接种后12h以内，将搅拌转速和通风比逐步提高至最大值；(3)在初始添加的葡萄糖消耗殆尽、溶氧快速升高至40％以上时，开始流加葡萄糖和硝酸盐，直至发酵72h结束。本发明采用补料分批发酵工艺，连续补加葡萄糖和硝酸钠为微生物生长和产酶持续提供碳氮源营养，硝酸钠的补加能促进芽孢杆菌对葡萄糖的利用，单位发酵液体积的纳豆激酶酶活能达到416‑1583FU/mL，与现有已报道的分批发酵和单独补糖的补料分批发酵水平(100FU/mL以下)有显著提高。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，特别涉及一种高产纳豆激酶的流加补料发酵方法。

背景技术

纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌分泌的具有强大溶栓活性的丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成，是一种单链多肽酶，无二硫键。纳豆激酶可以起到溶解血栓，净化血液，降低血压的效果，对心脑血管疾病有一定的预防和治疗作用，具有可口服、安全、持久和廉价等优势，被认为是新一代预防和治疗心脑血管疾病的理想天然溶栓药物，市场前景广阔。

纳豆激酶传统制备方法主要采用固态发酵，但该发酵方式存在营养浓度不均一、产热不易消散、产物得率低、分离提取困难等问题，难以实现纳豆激酶规模化高效生产。相比之下，液态发酵传质均匀，过程易于监测、控制和放大，近年来已成为纳豆激酶制备的主要方法。目前，纳豆激酶液态发酵使用的培养基中含有牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多种价格昂贵的组分，生产成本高。另外，纳豆激酶液态发酵方式主要采用分批发酵，虽然具有操作简单和不易染菌的优点，但也存在非生产时间长、设备利用效率低、发酵后期营养物质供应不足而导致产量低等诸多问题。因此，开发廉价有机物作为培养基组分，并通过补料工艺延长发酵时间、提高纳豆激酶产量，将有助于降低发酵生产成本和后处理难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产纳豆激酶的流加补料发酵方法，旨在使用廉价的豆粕为有机氮源，通过补料工艺延长发酵时间，提高单位发酵液的酶活。具体的操作步骤如下：

(1)活化地衣芽孢杆菌，制备成成熟的种子液；

(2)将种子液按1-5％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，初始搅拌转速200r/min，初始通风比0.5-1V/V·m，接种后12h以内，将搅拌转速和通风比逐步提高至最大值；

(3)在初始添加的葡萄糖消耗殆尽、溶氧快速升高至40％以上时，开始流加葡萄糖和硝酸盐，直至发酵72h结束。

进一步地，步骤(3)中流加的硝酸盐是指硝酸钠，硝酸钾或硝酸铵中的一种。

进一步地，硝酸盐可以加入葡萄糖补料液中随着葡萄糖一起补入发酵液，葡萄糖和硝酸盐的浓度比为10:0.5-2(w/w)。

进一步地，硝酸盐也可以单独补加，以0.25-0.75g/(L·h)的恒定速率补入硝酸盐。

进一步地，步骤(1)中所述的地衣芽孢杆菌菌种为Bacillus licheniformisBL10，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2013400。

进一步地，步骤(2)中所述的发酵培养基以豆粕作为有机氮源，各组分及含量：葡萄糖10-40g/L，豆粕粉20-100g/L，玉米浆3-8g/L，硫酸铵5-20g/L，硝酸钠5-25g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，硫酸镁0.1-1g/L，氯化钙0.1-1g/L。

进一步地，步骤(2)中所述的发酵培养基的装液量为40-60％(v/v)，搅拌转速和通风比最大值达到500-800r/min和2-4V/V·m。