[发明专利]乙酰胆碱酯酶活性检测方法

说明书

本发明提出了一种乙酰胆碱酯酶活性检测方法，包括如下步骤：依次将140μL磷酸盐缓冲液、10μL5,5′‑二硫双(2‑硝基苯甲酸)溶液、10μL乙酰胆碱酯酶溶液和10μL样品液混合，震荡孵育混合溶液；向混合溶液中加入10μL碘化硫代乙酰胆碱溶液进行反应，同时开启酶标仪，监测反应体系在405nm下的吸光度值；连续监测60min，每分钟测定一次吸光度值，得到吸光度值与监测时间的曲线。本发明的检测方法可以对乙酰胆碱酯酶活性的变化过程进行更加精确的测量。

技术领域

本发明涉及检测方法开发技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱酯酶活性检测方法。

背景技术

阿尔海默博士在1901年确诊了世界第一例的AD患者，可距今约120年过去了，人们依然没能揭示出AD确切的发病机制，目前存在的AD发病机制假说有Tau蛋白过度磷酸化假说、氧化应激假说、胆碱能假说、神经免疫炎症假说[9,10]、β淀粉样蛋白(Aβ)病变假说，其中有研究表明AD患者的基底前脑的胆碱能神经细胞缺失，乙酰胆碱酯酶的活性升高，而作为神经递质的乙酰胆碱含量下降，因此针对该假说以乙酰胆碱酯酶为靶点通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性是治疗AD的经典策略。

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，乙酰胆碱酯酶)是一种丝氨酸蛋白酶，具有氨肽酶和羧肽酶的活性，主要存在运动神经终板突触后膜和脑部的神经突触中，主要功能是将作为神经递质的乙酰胆碱水解，起着终止神经传导的作用，另外乙酰胆碱酯酶也参与了神经细胞的成熟和发育，能促进神经元的再生和发育。乙酰胆碱酯酶的活性部位有三个主要区域，主要起催化作用的位点位于一个深而狭长的‘谷底’底部，由Ser203，His447以及Glu334三个残基组成，另一个位点称为外周阴离子位点，由Tyr72，Tyr124，Trp286以及Tyr341和Asp74残基组成，主要起到固定底物乙酰胆碱的作用，还有一个疏水性区域是由络氨酸或色氨酸等芳香族氨基酸组成，在与芳香基底物结合时起着重要的作用。

基于AD发病机制的胆碱能假说，抑制乙酰胆碱酯酶的活性可显著增加中枢乙酰胆碱的含量，使乙酰胆碱得以在突触处积累，多项临床实验研究表明轻-中度的AD患者在服用乙酰胆碱酯酶抑制剂6个月后，其认知功能得到明显改善。

他克林(Tacrine四氢氨基吖啶)是第一个被FDA批准的用于治疗轻-中度AD的上市药物，为非选择性可逆的乙胆碱酯酶抑制剂，属于第一代乙酰胆碱酯酶抑制剂，极易透过血脑屏障，但是临床研究表明具有较强的肝毒性以及消化道不良反应。

利斯的明(rivastigmine)又名重酒石酸卡巴拉汀，属于第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂。临床研究表明，服用利斯的明可以明显抑制大脑海马和皮层的乙酰胆碱酯酶的活性，从而有效的提高乙酰胆碱的含量，且对乙酰胆碱酯酶的抑制作用可以长达24h，属于长效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。

多奈哌齐(donepezil)属于苄基哌啶类化合物，是第三代的乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制剂，其对乙酰胆碱酯酶抑制的ICsq是他克林的1/8，而且多奈哌齐的药物副作用较低并没有明显肝毒性，因此无论在药效以及安全性上都比他克林要好，多奈哌齐已成为治疗轻-中度AD的一线用药。

随着全球人口老年化的问题的不断加剧，AD成为人们亟待解决的问题，可是因为缺乏对AD发病机制确切的了解，再加上现在针对Aβ沉积假说的大行其道，导致AD一直是新药研发的重灾区，有研究数据统计AD新药领域临床实验失败率高达99.6％，辉瑞、礼来等医药巨头纷纷在AD新药研发中折戟，而乙酰胆碱酯酶是目前AD研究中最值得信耐的作用靶点，因此研究更加高效低副作用的乙酰胆碱酯酶抑制剂十分重要，以乙酰胆碱酯酶为靶点的抗AD药物必然会有较好的应用前景。

近年来，从天然药材中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂已经成为药物研发领域的研究终点，筛选的方法主要采用体外抑制活性法配合吸光度终点法检测，具体的，乙酰胆碱酯酶与底物反应后产生具有具有颜色的产物，通过检测产物的吸光度，判断乙酰胆碱酯酶的活性，但是在实际的检测过程中，部分样品的反应速率慢，导致终点法无法准确测得其抑制活性，而部分样品存在分解问题，从而导致终点法测得抑制活性偏低。