[发明专利]一种生物酶法水解核苷的方法

说明书

本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20‑50℃，pH为3.0‑6.0，反应在CaClsubgt;2/subgt;或Ca(HCOsubgt;3/subgt;)subgt;2/subgt;存在的条件下进行，CaClsubgt;2/subgt;或Ca(HCOsubgt;3/subgt;)subgt;2/subgt;的浓度为5‑50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100‑400mM。本发明实现了在酸性条件下完全水解嘌呤核苷转化为对应碱基，对嘧啶核苷的水解率也超过95％。本发明的生物酶法水解核苷可以缩短生产周期，仅需要6‑12h即可获得产物，可以避免产物浓度低，分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种核苷，具体来说是一种生物酶法水解核苷的方法。

背景技术

核苷是一类由嘌呤碱基或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖组成的化合物。核苷的水解产物主要包括腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶等碱基，它们在食品、化妆品、医药等多个行业有着广泛的用途。例如鸟嘌呤可用于化妆品着色剂、颜色添加剂、遮光剂(Panush S,et al.Subtle patina metallic coatings contain guanine.EP439112)。次黄嘌呤具有降血压、平喘、治疗痛风等药理活性(宋艳等.兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化.中国生化药物杂志,2012.33(06))。在农业生产上，次黄嘌呤具有杀菌作用，可用作农药中间体。胞嘧啶可用于合成抗艾滋病药物及抗癌药物。由于嘌呤碱基和嘧啶碱基用途广泛，因而其生产研究越来越受到重视。

目前，嘌呤碱基和嘧啶碱基具有工业化前景的生产方法主要包括酶水解法和化学合成法。其中化学合成通常需要高温高压的环境，还会用到大量有毒害的试剂，更重要的是底物转化率不高，限制了此类物质的生产。酶水解法是以核苷水解酶为催化剂，以多种核苷为原料，经一步酶促反应切割核苷的糖苷键获得对应碱基。核苷水解酶根据偏好的底物可进行分类，常见的有胞苷-尿苷核苷水解酶、肌苷-腺苷-鸟苷核苷水解酶等。Maciej等人从黄羽扇豆种子中纯化出偏好鸟苷-肌苷的核苷水解酶，在添加二价阳离子情况下酶活性达到最大(Maciej,et al.Calcium-stimulated guanosine–inosine nucleosidase fromyellow lupin(Lupinus luteus).Phytochemistry.2006,67(14))。孟等鉴定了谷氨酸棒杆菌来源三种核苷水解酶的酶学性质，发现它们都能够水解腺苷、胞苷、鸟苷、肌苷和尿苷，但底物偏好性有差异(孟燕等.谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究.食品与发酵工业,2022)。但是，目前报道的核苷水解酶的最适工作pH都接近中性，这非常不利于底物溶解。此外，水解反应的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化的难度。

因此，研发一种能在酸性环境下生物酶法高效彻底水解核苷的方法是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，所述的这种生物酶法水解核苷的方法要解决现有技术中水解核苷的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化难度的技术问题。

本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20-50℃，pH为3.0-6.0，所述反应在CaCl₂或Ca(HCO₃)₂存在的条件下进行，CaCl₂或Ca(HCO₃)₂的浓度为5-50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100-400mM；

所述核苷水解酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；