[发明专利]一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明提供了一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体的重链CDR3包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链CDR3包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。所述单克隆抗体能与Dsg3特异性结合，亲和力高，能够定量检测PV患者中抗Dsg3自身抗体水平，监测病情活动度，可用于PV患者的临床诊断。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用。

背景技术

天疱疮是一种自身免疫性疾病，其具有寻常型、增殖型、落叶型和红斑型这四种亚型。寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris，PV)是一种主要累及皮肤和黏膜的大疱性皮肤病，PV在临床上较为常见。患者血清循环中存在针对角质形成细胞间蛋白结构的自身抗体，破坏细胞间黏附功能，从而出现以表皮内水疱为主的临床表现。约60％的PV患者会出现口腔黏膜的水疱、大疱，且自发破溃，糜烂面难以愈合，严重影响患者进食及日常生活，给患者身心带来极大痛苦。此外，一部分的患者仅表现为持续性的口腔黏膜糜烂而无任何皮肤损伤。因此，需要快速、准确诊断PV的有效检测手段。

PV的早期诊断对治疗和预后具有极其重要的作用，PV的诊断包括临床表现、组织病理和免疫诊断指标。临床表现：①皮肤出现松弛性水疱和大疱，易破溃；②水疱和大疱破溃后形成顽固性糜烂；③黏膜出现水疱或糜烂；④尼氏征阳性。组织病理：表皮或上皮细胞间棘层松解，形成水疱和大疱。免疫诊断指标：①皮损区域或皮损周围正常皮肤直接免疫荧光(DIF)示IgG和/或补体沉积于表皮(或上皮)细胞间；②间接免疫荧光(IIF)检测到血清中出现抗表皮细胞间抗体；③ELISA检测到血清中出现抗Dsg抗体。满足临床表现中的至少1条加上组织病理和免疫诊断指标中的至少1条即可确诊。满足临床表现中至少2条加上免疫诊断指标中2条亦可确诊。

在PV的诊断过程中需要高亲和力的抗Dsg3单克隆抗体，经典的杂交瘤技术需要耗费大量的时间和精力去获得高亲和力的抗体，而且需要进行后续的人源化改造，这导致难以通过杂交瘤技术获得人源单克隆抗体。

噬菌体展示技术已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体抗体库技术是通过制备人源抗体文库(library)，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，从而筛选并富集特异性抗体。从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体，因此，当使用噬菌体抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段(Fab或ScFv)。噬菌体抗体库技术不需要经过免疫和人源化改造步骤，依靠在完全可控的生物化学环境中进行富集筛选，实现短期内筛选到较高亲和力的全人源人类抗体序列。

寻常型天疱疮的病理特点为表皮内水疱及棘层细胞松懈，导致该病理改变的直接原因是抗棘层细胞间质抗体，几乎所有的活动性天疱疮病人血清中都存在这种抗体，PV抗体作用的靶抗原位于表皮细胞间的连接结构-桥粒上，为跨膜桥粒核心蛋白(desmoglein3，Dsg3)。Dsg3分子量为64.95KD，属于钙粘素(Cadherin)的超家族成员之一，在维持表皮的完整性方面发挥重要作用，其结构的破坏可导致棘刺松懈，引起表皮内水疱。Dsg3的细胞内成分通过桥斑盘状蛋白与细胞骨架相互作用并构成连接，胞外区则介导细胞间的连接，Dsg3的胞外区提供了PV抗体识别的抗原表位。Dsg3中起主要作用的区域被称为细胞外功能区(extracellular domain，EC)，Dsg3的EC分为5个结构域(EC1-EC5)，EC-1位于氨基端，EC-5位于羧基端。Dsg3分子的天然立体构象对激发自身免疫性大疱很重要。已有的研究通过杆状病毒表达系统和哺乳动物表达系统获得人Dsg3重组蛋白，包括Dsg3的整个EC，所得人Dsg3重组蛋白可以与人PV患者血清的天然抗体特异性结合。人Dsg3重组蛋白不仅可为诊断PV提供可靠的手段，还可用于进一步研究天疱疮的发病机理。