[发明专利]基于酶辅助固相微萃取荧光响应传感器、制备方法和应用

说明书

本发明公开了基于酶辅助固相微萃取荧光响应传感器、制备方法和应用，所述传感器包括表面依次经羟基化和氨基化的石英棒，羧基修饰的2GDNA序列；其中，2GDNA序列偶联在石英棒表面，2GDNA序列为SEQ ID NO.1。优点在于：(1)本发明在固相微萃取探针上设计了反应单元和荧光检测单元两个模块，有利于减少实验干扰，去除基质效应，提高反应速率；(2)所述方法所需样品量较少，且无需繁杂的前处理提取过程；(3)本发明将样品中抗生素的含量转化为荧光仪器的荧光强度值，检测方法操作简单便捷，检测迅速，运用适用于高灵敏快速检测分析，不需要进行单荧光素修饰，无需修饰猝灭剂，具有成本低的优点。该方法使用荧光光谱仪进行荧光信号检测，链霉素的检出限为0.01084nM。

技术领域

本发明属于食品安全分析技术领域，涉及核酸适配体亲和捕获反应与Nt.BstNBI酶剪切与杂交链式反应引发荧光信号检测方法，具体为基于酶辅助固相微萃取荧光响应传感器、制备方法和应用。

背景技术

养蜂业中常用的抗生素包括氯霉素、四环素、链霉素等，抗生素在治疗蜜蜂疾病的同时，无法代谢完全的抗生素就会残留在蜂蜜中，影响蜂蜜食品的质量。

现有技术中的抗生素分析方法包括荧光法、色谱-质谱联用法、比色法、化学发光法、酶联免疫吸附法、免疫层析法和电化学法等。近年来，生物传感器结合了表面等离子体共振(SPR)、荧光、比色、电化学传感器技术，被认为是一种强大的分析测试工具，许多生物传感技术被开发出来，以提供经济、便捷和灵敏的抗生素检测平台。虽然这些分析方法已经对抗生素实现了检测，但这些方法仍然有许多局限性，如操作过程复杂、灵敏度低，以及检测方法特异性不足。而开发高选择性、高灵敏度的抗生素检测方法对蜂蜜食品安全至关重要。核酸具有良好的功能化和生物相容性，它可以作为基底或者生物传感器信号介质。通常核酸传感利用寡核苷酸之间严格的碱基互补配对和特异性的亲和力，例如通过SELEX技术筛选出的核酸适配体，对于临床监测、食品污染物检测、环境污染分析物的特异性结合，核酸常用于高通量度、高灵敏和高特异性分析检测中，可分为酶促信号转化和非酶促信号转化。酶促信号释放方法具有特异性强和高稳定性的特点，例如Nt.BstNBI切刻内切酶特异性切割双链DNA底物其中一条单链作为功能信号分子；非酶促信号释放可在无生物酶分子的参与下，利用核酸分析之间熵值差异，例如DNA之间的结合竞争，实现信号释放。

石英玻璃材料由于属于SiO₂材料具有稳定性和特异性功能化，应用于核酸生物传感探针制备可以显著提高核酸生物传感探针的性能，可用于制备固相微萃取探针。固相微萃取探针在实验室具有良好的兼容性，具有试剂和样品消耗低、实时检测、分析平台小型化、检测方便和价格低廉等优点，在生物传感器研究中具有重要意义。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明利用G四链体二聚体序列与ThT结合荧光信号的差异，当存在STR时，STR被Aptamer捕获，剩余的Aptamer与石英棒传感器表面核酸序列互补结合。利用Nt.BstNBI酶辅助剪切互补双链的特定位点并释放G四链体二聚体序列，进行高灵敏检测。在本发明的检测策略中，仅G四链体二聚体作为荧光标记物，不需要其他猝灭剂，大大降低了经济成本。鉴于此，本发明提供了基于酶辅助固相微萃取荧光响应传感器、制备方法和应用。

技术方案：基于酶辅助固相微萃取荧光响应传感器，所述传感器包括表面依次经过羟基化和氨基化的石英棒，羧基修饰的2GDNA序列；其中，2GDNA序列偶联在石英棒表面，2GDNA序列为SEQ ID NO.1：5’-TTTTTGAGTCACGACCCGACAGAGGGCGGGATGGGGGGTTGGGCGGGATGGG-3’。

优选的，所述传感器在链霉素存在的环境中，链霉素被核酸适配体SEQ ID NO.2(序列为：5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGTGACTC-3’)捕获，过量的适配体与传感器表面的2GDNA序列互补结合，利用切刻内切酶Nt.BstNBI辅助剪切互补双链释放G四链体二聚体序列，G四链体二聚体序列与ThT结合，实现荧光增强响应。