[发明专利]一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法及应用

说明书

本发明公开了一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法及应用。（1）称取米粒装入EP管；（2）配制提取缓冲液；（3）向EP管内加入新制的提取缓冲液，沸水浴孵育，迅速冷却；（4）加入钢珠到EP管内，将米粒研磨至匀浆；（5）依次加入α‑淀粉酶和提取缓冲液，涡旋混匀，室温静置；（6）加入蛋白酶液，涡旋混匀，置于37℃水浴孵育1h；（7）沸水浴终止反应，迅速冷却；（8）离心吸取上清液，加入大鼠血清，涡旋混匀，37℃水浴孵育；（9）沸水浴灭活，迅速冷却；（10）离心吸取上清液，即得稻米样品叶酸提取物，分装至避光无菌管中可直接测定或冻存于‑80℃备用。本发明微量、稳定、准确，省时省力、效率高，成本低。

技术领域

本发明属于稻米品质分析技术领域，具体涉及一种通过EP管利用三酶法微量、稳定提取稻米叶酸的方法及其在微生物法叶酸测定中的应用。

背景技术

叶酸是一种水溶性B族维生素，化学名称为蝶酰谷氨酸，也称为VB₉、VB₁₁、维生素Bc、维生素M，分子式为C₁₉H₁₉N₇O₆，是四氢叶酸及其系列衍生物的总称。叶酸在人类营养和健康方面具有关键作用：参与调节胚胎神经细胞发育来预防新生婴儿患先天性神经管缺陷症；作为抑郁症患者的辅助治疗剂从而缓解精神压力；治疗慢性萎缩性胃炎以及防治心肌损伤和心肌梗塞等疾病；缺乏时有引发直肠癌的危险；还可能与阿尔茨海默病以及智力下降有关。人类自身不能合成叶酸，只能依赖食物来摄取；作物是人类的主要食物，水稻又是主要的粮食作物；稻米为世界大部分人口提供每日摄入热量的80％，但其必需微量元素含量较低，绝大多数水稻品种叶酸含量也偏低。

生物体内叶酸的代谢过程较为复杂，叶酸是介导一碳单位转移反应的重要辅助因子，广泛参与生物体内核酸、氨基酸和泛酸盐等重要代谢反应及植物木质素形成和光呼吸等过程。叶酸对光敏感、易氧化、易破坏且常温难保存；不同植物中叶酸含量存在较大差异，绿叶蔬菜、水果和豆类的叶酸含量较高，而禾谷类作物的叶酸含量较低。不同物种中叶酸的稳定提取尤其是叶酸含量偏低的稻米中的总叶酸提取具有一定困难。

叶酸提取的质量高低直接影响到总叶酸及其各衍生物组分测定结果的准确性，是首要的关键问题。目前，植物叶酸的提取方法主要有单酶法、三酶法、超声波萃取法等。单酶法适用于碳水化合物和蛋白较少的组织样品，能够有效提取菠菜等绿叶类组织及黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶酸；三酶法相对于单酶法能够更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基质的叶酸，常用于豆类、谷物类等种子的叶酸提取且效率较高；而超声波提取法则较常用于叶酸片中的叶酸提取。可见，对于不同植物和组织的叶酸提取，需要择优方法，不可盲目使用。稻米主要含有水分、碳水化合物（淀粉、纤维素、半纤维素和可溶性糖等）、蛋白质、脂类（脂肪和类脂）、矿物质和维生素等，目前专门针对稻米总叶酸提取的方法还未见报道。目前，稻米总叶酸提取只能参考其他植物和动物甚至是食品的方法来进行，导致现有的稻米叶酸测定存在许多问题，如现有测定方法需要样品量大，测定程序中使用的耗材规格大导致精准度低，整个流程所需仪器数量多且费时费力、效率低下等等，无法满足当前高叶酸水稻品种选育和高叶酸稻米产品研发高效检测需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法及应用。

本发明采取的技术方案是：

一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法，通过EP管利用三酶法微量提取稻米总叶酸，按照以下步骤、在弱光条件下进行：

（1）称取米粒0.2g，装入2.0mL EP管；

（2）配制浓度为0.05mol/L、pH值为6.8的磷酸缓冲液，在使用前加入质量体积百分比为1%的抗坏血酸钠和体积百分比为0.1%的β-巯基乙醇，充分溶解混匀，得提取缓冲液；

（3）向EP管内加入新制的提取缓冲液，沸水浴孵育10min，冰上迅速冷却；

（4）加入1枚5mm钢珠到EP管内，利用研磨机将米粒研磨至匀浆；