[发明专利]一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法及应用

权利要求书

1.一种微量、稳定的稻米总叶酸提取方法，其特征在于，通过EP管利用三酶法微量提取稻米总叶酸，按照以下步骤、在弱光条件下进行：

（1）称取米粒0.2g，装入2.0mL EP管；

（2）配制浓度为0.05mol/L、pH值为6.8的磷酸缓冲液，在使用前加入质量体积百分比为1%的抗坏血酸钠和体积百分比为0.1%的β-巯基乙醇，充分溶解混匀，得提取缓冲液；

（3）向EP管内加入新制的提取缓冲液，沸水浴孵育10min，冰上迅速冷却；

（4）加入1枚5mm钢珠到EP管内，利用研磨机将米粒研磨至匀浆；

（5）向匀浆中依次加入α-淀粉酶10μL和提取缓冲液，涡旋混匀，室温静置10min；

（6）加入60μL（10mg/mL）蛋白酶液，涡旋混匀，置于37℃水浴孵育1h；

（7）取出，置于沸水浴10min以终止酶反应，冰上迅速冷却；

（8）4℃、14000rpm离心10min，小心吸取上清液，向上清液中加入3%体积比的“大鼠血清”，涡旋混匀，置于37℃水浴孵育2h；

（9）取出，置于沸水浴10min已灭活，冰上迅速冷却；

（10）4℃、14000rpm离心15min，小心吸取上清液，即得“稻米样品叶酸提取物”，分装至避光无菌管中可直接测定或冻存于-80℃备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中磷酸缓冲液由NaH₂PO₄•2H₂O和Na₂HPO₄•12H₂O配制的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）和步骤（5）在提取糙米时加入的提取缓冲液均为750μL，在提取精米时加入的提取缓冲液依次分别是1000μL和500μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）研磨频率为70Hz，提取糙米研磨时间为300s、提取精米研磨时间为240s。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（5）加入α-淀粉酶是来自于米曲霉且≥800FAU/g，步骤（6）加入的蛋白酶是来自灰色链霉菌且≥3.5unite/mg。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（8）中加入大鼠血清是无菌采血的并经过活性炭吸附：将大鼠血清提前从-20℃取出至4℃缓慢解冻且混匀，无菌条件下按照10:1的体积质量比加入经高温灭菌干燥的活性炭粉末，涡旋震荡15s混匀，置于冰浴1h，间隔混匀3～5次，4℃、14000rpm离心15min，无菌条件下吸取上清液后使用0.22μm无菌滤膜过滤，分装滤液至无菌EP管，保存于-20℃备用。

7.根据权利要求1所述的方法的应用，其特征在于，所述提取的稻米总叶酸利用微生物法测定其含量。