[发明专利]一种外泌体分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：将CD36适配体修饰到磁珠表面，得到CD63适配体磁珠；将细胞上清液与CD63适配体磁珠混合反应，通过CD63适配体磁珠捕获外泌体，得到CD63适配体磁珠‑外泌体吸附物；对CD63适配体磁珠‑外泌体吸附物进行固液分离，得到磁珠吸附物；对得到的磁珠吸附物进行洗涤，得到提纯后的外泌体。基于外泌体的特性，可以有效克服常规的外泌体富集技术存在的对脂蛋白等杂质共分离的缺陷，提高富集外泌体的纯度，配合后续的洗脱液，可是实现外泌体的无损释放，减低了对外泌体结构的破坏，保证了外泌体结构的完整性，不影响下游分析，本发明公开的方法真个分离周期用时短，CD63适配体也可以在体外快速批量合成，成本低。

技术领域

本发明属于外泌体分离提取技术领域，涉及一种外泌体分离纯化方法。

背景技术

外泌体最早于1983年被发现，是一种尺寸在30-150nm之间的几乎所有哺乳动物细胞都能分泌的囊泡。它具有脂质双分子层膜结构，呈典型的杯状形态。通常包含蛋白质、脂质、mRNA、microRNA等功能分子，广泛存在于各种体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等。外泌体参与细胞间物质交换和信息传递，调节免疫反应、肿瘤侵袭、细胞增殖等生物学行为，具备成为相关疾病诊断可靠生物标志物和疾病治疗药物载体的天然优势和巨大潜力。但是，受限于外泌体所处体液环境的成分复杂性和外泌体自身的纳米级尺寸尺寸，从各种体液中分离获取高纯度和功能结构完整性的外泌体仍具有很大挑战性。

目前，常用的外泌体分离提纯方法有超速离心法(UC)、免疫亲和法、聚合物沉淀法、纳米膜过滤法、尺寸排阻色谱法等。其中超速离心法(UC)是外泌体分离提纯的黄金标准，但是该方法耗时长、产量低，依赖于昂贵的精密仪器设备，同时多次的超速浓缩可能会损坏外泌体的结构完整性，不利于外泌体的下游分析应用。基于外泌体尺寸、密度、溶解度等物理特性的其它分离技术也存在产量低、纯度低、耗时较长等问题。因此，亟需建立一种可以实现外泌体高纯度快速分离回收的新方法。

免疫亲和法是基于抗原抗体特异性识别结合的原理来实现外泌体分离的一种常用方法，利用免疫磁珠法提取的外泌体纯度高、分离效率高、操作简便。最常采用的免疫磁珠修饰方法是将生物素标记的捕获抗体固定在链霉亲和素磁珠表面，以制备外泌体捕获磁珠，但该方法制备的磁珠难以实现对捕获外泌体的无破坏性释放，且修饰捕获抗体的磁珠使用成本较高，限制了该方法在外泌体大规模生产和临床研究中的应用，可见，现有外泌体提取技术缺乏一种分离成本低、耗时短、纯度高、不影响外泌体形态结构和生理功能的分离技术。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中外泌体在分离提纯时成本高，耗时长，同时容易破坏外泌体的形态结构和生理功能，破坏外泌体结构的完整性，不利于外泌体下游分析的问题，提供一种外泌体分离纯化方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：

S1：将CD36适配体修饰到磁珠表面，得到CD63适配体磁珠；

S2：将细胞上清液样本与CD63适配体磁珠混合反应，通过CD63适配体磁珠捕获外泌体，得到CD63适配体磁珠-外泌体吸附物；

S3：对CD63适配体磁珠-外泌体吸附物进行固液分离，得到磁珠吸附物；

S4：对得到的磁珠吸附物进行洗涤，得到提纯后的外泌体。

本发明的进一步改进在于：

所述步骤S1包括在磁珠的表面依次修饰有Strep-tagII、Strep-Tactin和CD63适配体。

所述步骤S2中，预处理后的细胞培养上清液样本的体积与CD63适配体磁珠的用量比为(90-110)μl：0.1mg。

所述步骤S2中，细胞上清液样本与CD63适配体磁珠在室温下振荡孵育25-30分钟。