[发明专利]一种蛋白材料固定L-TA与L-TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用

说明书

本发明公开一种蛋白材料固定L‑TA与L‑TAAAS的制备方法及其在产去甲肾上腺素上的应用。本发明以3,4‑二羟基苯甲醛和甘氨酸为出发底物，经L‑TAs催化发生羟醛缩合反应生成屈昔多巴，后者再经L‑AAADs作用生成产物NE。相较于化学法其更为环保，省去了不少步骤，相较于传统生物法，其更利于工业生产，克服了游离酶的缺点。两种固定化酶载体制备工艺简单，成本低廉，反应过程基本仅需要简单搅拌，反应物市面上均可买到且价格低廉。

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种蛋白材料固定L-TA与L-TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用。

背景技术

去甲肾上腺素是抗感染性休克的首选药物，用于改善组织灌注与氧输送，降低血乳酸水平，在感染休克治疗期间，NE同样通过以上方式在改善脑功能方面发挥独特作用和优势。

目前传统的体外制备去甲肾上腺素的方法均为化学合成法。主要是以氯乙酰儿茶酚为起始原料，经过氨化、催化氢化及L-酒石酸拆分成功合成(-)-重酒石酸去甲肾上腺素。或者是以章鱼胺盐酸盐为原料，经氨基保护，氧化和脱保护合成了(±)-去甲肾上腺素盐酸盐。合成路线通常较长，对设备和生产环境的要求也较高。生物合成法往往具有绿色、环保、安全、条件温和等优点，且有望克服传统化学制备过程中的诸多缺点。但是由于游离酶的重复利用性差，稳定性不好等特性，使其无法有效的利用于工业生产中，固定化酶则可以有效克服其缺点。增强其稳定性与重复利用性，有利于工业化的连续生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蛋白材料固定L-TA与L-TAAAS的制备方法与其在产去甲肾上腺素上的应用。本发明以基于L-苏氨酸醛缩酶和L-芳香族氨基酸脱羧酶级联催化合成去甲肾上腺素的生物合成路线，以3,4-二羟基苯甲醛和甘氨酸为出发底物，经L-TAs催化发生羟醛缩合反应生成屈昔多巴，后者在L-AAADs作用生成产物NE。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种蛋白材料固定L-TA与L-TAAAS的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，室温下，取1mL 10-100mg/mL的卵清蛋白溶液,50-300rpm下加入5mL DMSO、最后加入50mmoL、浓度为50-75mmol/L Tris-HCl缓冲溶液补至11mL，形成白色沉淀后；提高转速至300-600rpm反应30min得白色悬浊液，以4000-8000rpm离心洗涤3次，每次洗涤10min，得非质子极性溶剂介导的纳米材料；

步骤2,将非质子极性溶剂介导的纳米材料加入同体积的水分散后，，加入L-苏氨酸醛缩酶，且L-苏氨酸醛缩酶的终浓度为1-4g/L，25℃-40℃下恒温搅拌12H转速300转，之后用PBS缓冲液洗涤3次，冷冻干燥到恒重，得固定化L-苏氨酸脱羧酶；

步骤3，取20-80μL 1mol/L二甲基咪唑，金属离子20-80μL，L-芳香族氨基酸脱羧酶，最后加入纯水至5ml，其中，L-芳香族氨基酸脱羧酶的终浓度为1g/L-4g/L将配好的反应体系放入磁力搅拌器，反应30min，离心洗涤，收集上清液进行蛋白检测，计算蛋白量和固载率，同时取最后一次离心的沉淀，冷冻干燥到恒重，获得沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L-芳香族氨基酸脱羧酶。

作为改进的是，步骤1中卵清蛋白溶液的浓度为60mg/mL，所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为50mmol/L。

作为改进的是，步骤3中固定L-芳香族氨基酸脱羧酶时，二甲基咪唑的加入量为80μL，金属离子为Zn²⁺,加入量为40μL。

作为改进的是，L-TA的固定化酶终浓度为2g/L，L-芳香族氨基酸脱羧酶固定化酶终浓度为2g/L。

上述的沸石咪唑酯骨架结构材料包埋的固定化L-芳香族氨基酸脱羧酶在生产去甲肾上腺素上的应用。