[发明专利]一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析

说明书

本发明公开了一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析，属于银杏基因工程技术领域，本发明选择了lnc10和lnc11作为研究对象，从银杏叶片中成功克隆出lnc10和lnc11，并利用转基因和转录组测序等方法对其进行功能验证，从分子水平上揭示了银杏lnc10和lnc11对类黄酮生物合成具有正向调节作用，初步阐明了银杏lnc10和lnc11对类黄酮合成的调控机制，为lncRNA调控类黄酮的合成提供了理论依据。

技术领域

本发明属于银杏基因工程技术领域，具体涉及一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析。

背景技术

银杏是银杏科银杏属唯一存活的孑遗植物，被认为是植物界的“活化石”。银杏具有极高的生态、经济、观赏和药用价值。黄酮类化合物是银杏中主要的次生代谢产物，广泛应用于食品、医药和天然保健品领域，在医学、科研等领域具有较高的研究价值，具有广阔的发展前景。长链非编码RNA(lncRNAs)通常是大于200nt、ORFs小于100aa且无明显蛋白编码能力的真核RNA，在植物体内的生命活动和发育过程中扮演着重要角色。尽管有关银杏类黄酮生物合成的研究较多，但大多数都集中在结构基因和转录因子调控类黄酮合成的分子机制上，而有关lncRNAs对银杏类黄酮合成生物学功能的研究报道很少。前期研究发现银杏中lnc10和lnc11等lncRNA可能参与类黄酮的合成，但是，其调控机制尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，包括如下步骤：

(1)根据银杏转录组数据库筛选出两个参与类黄酮合成的IncRNA，分别命名为Inc10和Inc11；

(2)克隆Inc10和Inc11基因；

(3)qRT-PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量；

(4)构建Inc10和Inc11过表达载体。

进一步地，步骤(2)中所述的Inc10和Inc11基因的克隆包括以下步骤：

1)分别采取新鲜的银杏根、茎、幼嫩叶、成熟叶、雄球花、雌球花、果实七个独立样本，将采集的材料迅速冻于液氮中，保存于-80℃冰箱中备用；

2)参照RNA提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书进行RNA的提取；

3)参照RNA反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RNA反转录；

4)以cDNA为模板，利用2×Rapid Taq Master Mix扩增lncRNA。

进一步地，步骤(3)中所述的qRT-PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量具体为：以根、茎、叶、雄球花、雌球花和果实中7个组织的cDNA为模板，选取银杏GbNADPH作为内参基因，利用IDT在线网站设计特异性定量引物，进行实时定量PCR扩增。

进一步地，步骤(4)中所述的Inc10和Inc11过表达载体的构建，包括如下步骤：

1)对pBI121-GUS选用Xba I和Xma I进行双酶切，37℃酶切1h，65℃水浴20min，使酶失活；

2)采用电泳检测上述酶切产物，并检测产物浓度。根据II One StepCloning Kit说明书，按照载体与插入片段摩尔比为1:2的比例进行重组反应，37℃反应30min，将重组产物通过的热激法转入到DH5α并进行阳性验证和测序。